第五章微生物药物产生菌的菌种选育

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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•诱变处理的兴起 • 1927年,美国遗传学家缪勒(H.J.Muller,1890—1967) 首次发现用X射线照射果蝇精子后，果蝇后代发生突变 的个体数大大增加。同年,又有科学家用X射线和g射线 照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。
• 第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学 诱变剂——芥子气，开辟了化学诱变的新途径。
•自发突变(spontaneous mutation)：自然条件下, 菌株也 会发生遗传或生理上的变化而造成产量的改变。突变有 着正向和反向的差别。
•在无性繁殖的细菌中,突变率是用每一个细胞世代中每 个细菌发生突变的概率，即用一定数目的细菌在一次分 裂过程中发生突变的次数表示, 约10-8。不同生物和同 一生物个体的不同基因的自发突变率不同。
• 2005.3, 英国剑桥先正达种子公司(Syngenta Seeds)报 道了第二代转基因“金大米” 胡萝卜素(防止失 明)含量增加了20倍。”
•国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量， 以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中， 大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。
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第五章微生物药物产生 菌的菌种选育
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2020/12/11
第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•基因突变是一切突变的内因。
•任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生 菌遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产 量和性质。
•微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育 种发面也有着重要作用。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
生物塑料
•Bohmert等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码3-酮硫 裂解酶(3-ketothiolase) 、乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetacetylCoA reductase) 和PHA合成酶(PHA synthase)的三个基因，构 建了PHB的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本 来没有的PHB，叶片中的含量达到鲜重的4%(约为干重的40%)。
转基因在本质上不同 。以BT（Bacillus thuringiensis产生的 可抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害） 为例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。 这个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗 传物质传递的现象，但是很少，也不可预期。
自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。
理性菌种选育(Rational strain improvement)
•是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等 机理透彻了解的基础上,有针对性地进行育种研究。
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•代谢工程(metabolic engineering)
•代谢工程是指运用重组DNA技术通过对微生物细胞内 的酶、转运和调节等功能进行操作以提高细胞活性的现 代生物技术。主要用于有价值的化合物的研究和开发， 在能源、原材料 、治疗用品的研究和开发等方面也起着 重要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。
•这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种 理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开 发产生深远的影响。
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•菲律宾的国际水稻研究所已开发出的“金大米”， 通过转基因技术让水稻制造β胡萝卜素(维生素A的前 体), 有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏 症。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
科学地看待问题：基于科学知识，而非基于逻辑推论和 有选择性的所谓常识
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•经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未 来属于遗传工程。
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•现代生物技术在微生物药物育种中的应用
•微生物的潜力是无穷的。
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•我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、 辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态”后生产 出来的，是“人定胜天”的结果。
•我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。
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•步骤：出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。
•诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选(screening)
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❖ 出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液 ❖ 诱变剂的选择：简便有效 ❖ 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质 ❖ 诱变剂量的选择
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•浅蓝菌素(cerulenin) 通过抑制聚酮体的前体 (也是脂肪酸 前体)小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生，因 此筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的生长菌落即可 能获得高产菌株。
•将道诺霉素产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生长 后，长出的菌落大多数因抗生素的生物合成被抑制而表现 为无色，呈现红色的即为产生抗生素的菌落，这样获得高 产菌株的机率就得到提高。
•代谢工程超越了基因扩增和基因表达调控, 强调在整体 水平对生物合成旁路的观察、代谢旁路的重建、热动力 学的稳定性、代谢物转化的速率及其控制。这就将单个 的酶反应转向了整体的代谢旁路和生物转化网络。
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应用领域
❖ 合成异源代谢产物 ❖ 扩大底物利用范围 ❖ 生产非天然的新物质, 如新型药物 ❖ 降解环境有害物质 ❖ 提高微生物对环境的适应能力 ❖ 阻断或降低副产物的合成 ❖ 提高代谢产物产率。
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•金大米
•从香叶基焦磷酸到b－胡萝卜素的生物合成需要 八氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱 饱和酶基因、－胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番 茄红素环化酶基因。
•Ye(2000) 使用来自欧文氏菌的八氢番茄红素脱饱 和酶基因（该基因能够同时承担植物八氢番茄红 素脱饱和酶基因和－胡萝卜素脱饱和酶基因的功 能）替代了相应的两个基因，使得酶促反应步骤 由4个减少为3个。
以模式菌株S. lividans建立了一个代谢流分析模型， 目标是阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳 代谢进行操作以提高其抗生素的产生。
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• A. 提高微生物药物的单位产量
➢增加限速酶所编码的基因的拷贝数：增加限速酶的拷 贝数可能增加抗生素的产量。
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•代谢工程正被运用于涉及抗生素生物合成的代谢旁 路的操纵。产生菌的生物化学和生理学的知识也提供 了直接改变代谢的合理基础。有可能通过测量前体和 中间产物的代谢流以及鉴别限速步骤以用作遗传操作 的靶点。通过分析可将代谢流指向所需的代谢产物并 消除不必要产物的生物合成。
➢ 结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变 株，可解除反馈抑制而提高产量。
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•五、根据产物特点而设计实验
b-内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗 菌作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味 着提高浓度的b-内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性， 即得到了高产菌株。
中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟 虫等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农 药用量。
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杂交和转基因
杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太 远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这 个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是 在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。
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•S. clavuligerus中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素
C
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➢ 引入抗性基因
•自身抗性的增加意味着更多抗生素的生成，如将氨基糖 甙类抗生素的抗性基因 氨基糖苷-6-N-乙酰转移酶 基因转化至卡那霉素和新霉素产生菌，转化子对多种氨 基糖甙类抗生素的抗性增加，而且卡那霉素和新霉素的 产量提高了2-6倍。
•自发突变因素: ❖ 宇宙射线 ❖ 环境中的低浓度物质 ❖ 温度的改变
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•自发突变的机理之互变异构效应假说
•腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亚氨基形式出现， 而鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出现。平 衡一般倾向与氨基和酮基配对，即DNA双链一般以AT ,GC为主。
从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱 变的工作在世界范围内广泛开展起来。
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•突变株的筛选方案的设计
➢ 高产突变株的筛选：
化合物抗菌活性的琼脂块法
➢ 形态突变株的筛选：
去除色素，孢子等
➢ 自身耐药突变株的筛选： 产量越高，对自身的抗性就越强
➢ 营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制
第五章微生物药物产生菌的菌种选育
2009年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因 玉米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生 产应用安全证书。
引发公众转基因食品安全性大争论。
中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的 利用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减 少动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保 护。此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、 低成本的优势。
•Slater等在拟南芥和油菜种子中表达上述三个基因的同时增加 了一个来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase) 基因，在植物中构建了新的生物合成代谢途径，使得拟南芥和 油菜能够产生3-羟基丁酸酯与 3-羟基戊酸酯的共聚物 (poly 3hydroxybutyrate-CO-3-hydroxyvalerate)。
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• 2004年1月13日，沃尔夫农业奖由中国的袁隆平与美国 康奈尔大学的塔克斯莱(Steven Tanksley)分享，以表彰他们 “对杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原 理”。 袁隆平从实践及推理中突破了水稻为自花传粉植物而无 杂种优势的经典观念的束缚, 成为继陈省身(沃尔夫数学奖)及 吴健雄(沃尔夫物理学奖) 之后第三个中国人。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•时间
•1943 •1943 •1943 •1945 •1955 •1971 •1977 •目前
•青霉素诱变史
•发酵单位(U/ml)
•100 •250 •500 •～850 •～8000 •～2万 •～5万 •5～10万
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•如果A以亚氨基形式出现，在DNA合成到达这一位置的 瞬间，通过DNA多聚酶的作用，新合成的DNA链上的 相对位置就是C，而不是T 。
如T以稀有的烯醇式形式出现，则错配G，而不是A 。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•经典(常规)育种：诱变育种 •诱变育种(induced mutation):利用物理或化学诱变剂 (mutagen)处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率 大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方 法，从中挑选少数符合目的的突变株(mutant)，以供生 产科研之用。
•
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丘成桐, 2010 沃尔夫数学奖
第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物， 是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的 开发和理论研究方面已走到了世界的前列。
•恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差 距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂 交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的 遗传基础是什么？