乳糖牛肉膏蛋白胨培养基的制备与高压蒸汽灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代 谢产物的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物 或积累代谢产物。培养基种类繁多。但无论如何，一般均应含 有水分、碳源、氮源、能源、无机盐以及生长因素等。 本实验所用的乳糖牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广 泛的细菌基础培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁 殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之 用。 基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨、和NaCl。其中牛肉 膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提 供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。
注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与 自备大口玻璃瓶
×1 试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3、加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。顺时针旋转拧 紧。红箭头朝右。
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4、打开电源开关，调节温度和保温时间，同时打开排气阀排气。
5、待水沸腾将冷空气完全排尽 后（排汽五分钟），关上排气阀。 让锅内的温度随蒸汽压力增加而 逐渐上升。当锅内的压力上升到 所需压力时，维持压力至所需时 间。 本实验在1.03MPa， 121℃条件下灭菌30min。
6、灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至“0”时，打开排气阀，将盖子打开一缝，利用锅内的余 热烘干灭菌物品，取出灭菌物品。
7、将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h。检查若无杂菌生长， 即可使用。
实验用主要玻璃器皿的包扎
1、培养皿 培养皿通常用旧报纸包 紧。一般取5～10套培养皿作一 包。注意培养皿的取向应一致。 包装时，一边卷滚，一 边将两头的报纸往内覆折。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引 起污染。（分装完毕后马上清洗）
6、加塞 培养基分装完毕后， 在试管口或三角烧瓶口上塞 上棉塞(或硅胶塞及试管帽 等)，以阻止外界微生物进 入培养基内而造成污染，并 保证有良好的通气性能。
7、包扎 加塞后，将全部试 管放入量杯中。用记号笔注 明培养基名称、组别、配制 日期。三角烧瓶加塞后，外 包牛皮纸，用麻绳以活结形 式扎好，使用时容易解开， 同样用记号笔注明培养基名 称、组别、配制日期。 注意：别把记号写在瓶塞、 试管帽、量杯上。
实验试剂与器材
试剂： 乳糖，牛肉膏粉，酵母粉，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，琼 脂粉，1mol/L NaOH，1mol/L HCl； 器材： 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器， 天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0), 棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
实验步骤
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。 同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜 或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基பைடு நூலகம்，影响细菌生长。
3、调pH 在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸, 用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌,并随时用pH试纸 测其pH,直至pH达本实验所需的6.8.反之,用1mol/L HCl进行调节。
pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。 配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌， 则琼脂因水解不能凝固。此时应将培养基的成分和琼脂分开灭菌 后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。
5、分装 利用培养基分装器将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 加样的量试管以其高度的1/4左右为宜。
10、无菌检查 将已灭菌培养基放入 37℃的温室中培养 24～48h， 看是否有杂菌长出，以检查灭 菌是否彻底。
高压蒸汽灭菌
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 思考题
实验目的
了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围 学习高压蒸汽灭菌的操作方法
实验原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加 压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸 气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后 关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，而增加了 锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度导致 菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
收尾时将露出来的纸头 一并折入里面。 最后，将包好的培养皿 放在手上轻轻晃动，以不发 出玻璃的碰撞声为妥。
2、移液管 包装前，先在干燥移液管距其粗头顶端约0.5cm处塞一 段约1.5cm长的棉花。 包装时，先将移液管尖端斜放在报纸条的近左端，与 报纸约呈45°角，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上。
乳糖牛肉膏蛋白胨培养基的具体配方如下：
本次实验每组需配量：
乳糖 5.0g 牛肉膏粉 4.0g 酵母粉 5.0g 蛋白胨 10.0g 葡萄糖 10.0g NaCl 5.0g 琼脂粉 12.0g 水
乳糖 1.25 牛肉膏粉 1.00g 酵母粉 1.25g 蛋白胨 2.5g 葡萄糖 2.5g NaCl 1.25g 琼脂粉 3.00g
本实验所用的手提式灭菌锅结构如下：
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4321
7
12
10 11
13 8 14 9
DSX-280B（自动）
内部构造 5.压力表
1.下手柄 2.上手柄（内有安全锁） 3.排汽孔 4.放汽阀 6.安全阀 11.调温旋钮 7.桶身 8.底座 9.电源开关 13.保温灯
10.放水阀 14.时间旋钮
12.加热灯
再将整根移液管卷入报纸，右 端多余的报纸打一小结。 包好的移液管其管嘴端应该是钝头的。
3、打结 打结时，先用左手大 拇指摁住棉绳的一头，然后右 手拉住绳的另外一端在瓶口上 绕圈。最后打一活结。 第一圈应绕在大拇指上， 以方便后面打结。
思考题
1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基 是无菌的？ 2、在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？
3、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完 毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 4、在使用高压蒸汽灭菌锅时，怎样杜绝一切不安全因素？ 5、灭菌在微生物实验操作中有何重要作用？ 6、黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的胞子对热的抗性哪个更强？为什么？
实验4 乳糖牛肉膏蛋白胨培养基的制 备与高压蒸汽灭菌
乳糖牛肉膏蛋白胨培养基的制备 高压蒸汽灭菌 附：实验用主要玻璃器皿的包扎
乳糖牛肉膏蛋白胨培养基的制备
实验目的 实验原理 试剂与器材 实验步骤 思考题
实验目的
明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基 的一般方法和步骤
实验原理
实验器材
手提式高压蒸汽灭菌锅。 自配培养基及其他所需灭 菌物品。
实验步骤
1、首先将内层锅取出，再用纯水将外层锅的水面补齐到与三角搁架相平。
2、放回内层锅，并装入待灭菌物品。
本次实验需灭菌的物品为：
0.85％NaCl ×6
9ml （自配） 培养皿 ×10
10ml移液管 ×1 5ml斜面培养基 三角瓶装230ml 培养基 ×4 ×1
1、称量 按培养基配方比例依次 准确地称取葡萄糖、乳糖、酵母 粉、牛肉膏粉、蛋白胨、NaCl等 放入烧杯中。
称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品 后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的 水量，用玻棒搅匀，然后，在电炉上加热使 其溶解。 待药品完全溶解后，补充水到所需 的总体积。 将称好的琼脂放入已溶的药品中， 再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制 备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将 一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后 按1.2％～2.0％的量将琼脂直接分别加入各 三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热 溶化同步进行，节省时间。
本部分详见附录：实验用主要玻璃器皿的包扎
本次实验各容器封口方法
• 所有试管装样品用塑料试管帽封口 • 三角烧瓶用硅胶塞封口 • 自备玻璃瓶用二层铝箔封口
8、灭菌 将上述培养基以1.03MPa，121℃ ，高压蒸气灭菌 30min 。
9、搁置斜面 待灭菌的试管培养基 冷至50℃左右(以防斜面上冷 凝水太多)，将试管口端搁在 玻棒或其他合适高度的器具上， 搁置的斜面长度以不超过试管 总长的一半为宜。