实验动物组织切片免疫组织化学染色方法

ICS65.020.30

B44

中国实验动物学会团体标准

T/CALAS x-201x

实验动物组织切片免疫组织化学染色

方法

Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin

embedded tissues

（征求意见稿）

201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。

本标准由中国实验动物学会归口。

本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。

本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。

本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。

实验动物组织切片免疫组织化学染色方法

1范围

本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。

本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。

2术语和定义

以下术语和定义适用于本标准。

2.1

免疫组织化学immunohistochemistry,IHC

用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。

2.2

抗原antigen,Ag

一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。

2.3

抗体antibody

机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。

2.4

抗原修复antigen repair

利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。

3主要试剂

3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS）

先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠

（NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃

冰箱备用。用时取A 液13ml，B 液87ml，用1N 氢氧化钠或盐酸调pH 至7.6,加蒸馏水至2000ml。

3.20.05M Tris-HCL 缓冲液(PH7.6)

取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N 盐酸溶液42ml，定容至100ml，于4℃冰箱保存。临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M 缓冲液。

3.3柠檬酸抗原修复液

称取柠檬酸2.1g，加水至1000mL,用1N 盐酸调pH 至6.0。

3.4显色液

称取DAB 6mg 溶于10mL 0.05M Tris 缓冲液（pH7.6)中，然后加入0.1mL 0.3%过氧化氢(H 2O 2),此液需要现配现用。

4免疫组织化学方法（间接法）

4.1切片经二甲苯5min*2、无水乙醇5min*2、95％乙醇5min*2、85％乙醇5min、70％乙醇5min 完成脱蜡。脱蜡后自来水洗5min。

4.20.3%H 2O 2甲醇处理切片20min。

4.3水洗。

4.4抗原修复。

4.5PBS 洗3次，2min/次。

4,6加入血清于湿盒中孵育20min。

4.7倾去血清，加入一抗于湿盒中孵育60min。

4.8PBS 洗3次，2min/次。

4.9加入二抗于湿盒中孵育30min。

4.10PBS 洗3次，2min/次。

4.11用含0.5%DAB，0.02%H 2O 2显色液孵育切片5-10min。

4.12PBS 洗，水洗。

4.13Mayer’s 苏木素染核1min。

4.14水洗1min，蓝化10min。

4.15切片再经70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各1min，经95％乙醇1min*2、无水乙醇2min*2快速脱水后用二甲苯透明5min，重复一次。

4.16根据盖玻片规格和载玻片上组织多少，滴加适量中性树胶，封片。

4.17以PBS 代替一抗为阴性对照。

5操作要求

5.1离体组织固定尽早固定，越新鲜越好，以防止组织自溶，抗原扩散。

5.2组织脱水应彻底干净。组织块取材不宜太大过厚。

5.3切片应完整、均匀、平展、无皱褶。

5.4切片应烘烤附贴牢固。

5.5切片脱蜡应干净。

5.6应彻底抑制内源性过氧化物酶的活性。

5.7选择合适的抗体及对其作适当的保存和稀释才能取得较佳的实验效果。一般使用与二抗相同动物来源的非免血清进行封闭。

5.8根据需要，在实验步骤中增加内源性生物素阻断步骤。

5.9正确冲洗PBS溶液。

6抗原修复方法

6.1微波抗原修复法：0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10min。待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

6.2高压抗原修复法：切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续3min,待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

6.3水浴抗原修复法：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃）。即开始计时，持续40min。待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。

6.4煮沸抗原修复法：将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度。当达92℃后，即可拔离电源。当温度低于92℃时，再插上电源。如此反复持续至10min。待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。

7结果判定

7.1阴性对照为阴性时，阳性反应产物呈淡黄色、棕黄色和褐黄色粗颗粒。

7.2依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性（+++，指阳性细胞总数在50%以上)。