实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
病理免疫相关实验报告
病理免疫相关实验报告引言病理免疫学是病理学的一个重要分支，通过研究机体的免疫反应与疾病的关系，可以深入了解疾病的发生机制和免疫系统的功能。
本实验旨在通过免疫组化和免疫荧光技术，观察组织中的免疫反应，并利用免疫组化技术定位疾病相关蛋白的表达情况。
实验方法1. 采集实验样本：从实验动物身上取得肝脏组织样本，并快速冻存。
2. 准备试剂：准备免疫组化试剂盒，包括抗体、抗原修复液、二抗、染色液等。
3. 免疫组化染色：将样本切片后，经过脱脂、脱水和抗原修复处理后，使用抗体与样本进行共孵育，形成抗原-抗体复合物。
4. 免疫荧光染色：将切片样本经过脱脂、脱水处理后，使用荧光标记的抗体与样本中的目标蛋白进行结合，形成荧光抗原-抗体复合物。
5. 免疫组织化学染色：将切片样本经过脱脂、脱水处理后，使用酶联二抗体与样本中的目标蛋白结合，形成酶标抗原-抗体复合物，经过染色显色后可观察到目标蛋白的存在情况。
实验结果免疫组化染色经过免疫组化染色观察，发现肝脏组织中出现了抗体与目标蛋白结合后的染色信号。
对比对照组和实验组，发现实验组的染色强度明显高于对照组，说明目标蛋白在疾病组织中表达增加。
免疫荧光染色通过免疫荧光染色观察，可以直接看到标记了荧光的抗体与目标蛋白在组织切片中的位置与分布情况。
发现目标蛋白主要在肝脏组织的细胞核周围分布，显示出明亮的荧光信号。
免疫组织化学染色免疫组织化学染色观察显示，经过染色显色后，在目标蛋白存在的部位出现明显的颜色反应。
对比对照组和实验组，发现实验组的染色强度明显高于对照组，说明目标蛋白在疾病组织中表达增加。
讨论本实验通过免疫组化、免疫荧光和免疫组织化学技术，成功地观察到了疾病组织中目标蛋白的表达情况。
结果显示，在疾病组织中，目标蛋白的表达明显增加，与对照组有显著差异。
这一结果提示了目标蛋白可能与该疾病的发生发展密切相关。
在本实验中，我们选择了肝脏组织作为疾病组织样本。
肝脏作为一个重要的免疫器官，它在免疫应答中起着关键的作用。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
HE染色与免疫组织化学染色实验报告[最新]
![HE染色与免疫组织化学染色实验报告[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/73b03b285627a5e9856a561252d380eb63942342.png)
HE染色与免疫组织化学染色实验报告1实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
2.1.2脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
2.1.3浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。
将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。
2.1.5切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。
切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
2.1.6 脱蜡至水二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.7染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.8脱水和透明：95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
小鼠皮肤组织HE染色,免疫荧光染色
实验方案小鼠皮肤组织HE染色和免疫荧光染色HE染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞，固定液（4%多聚甲醛），PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯），石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等二实验步骤1.取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置PBS或生理盐水中充分漂洗残余血液2.将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜3.将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30min4.组织脱水：30%乙醇→50%乙醇→75%乙醇（可4℃过夜）→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇（各30min）5.透明：二甲苯透明3×20min（具体时间根据透明程度来设定，小鼠皮肤10min即透明，透明时如发现组织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净）6.浸蜡：4×30min（每30min换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用）7.包埋（注意组织摆放及横切，纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片(刚包埋好的热蜡块不能立即冷冻)8.切片（5-7um），摊片（40-45℃），烘片（62℃左右，充分烘干）9.HE染色：二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)→苏木精染液(1min)→流动自来水(3min)→50%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→85%乙醇(1min)→95%乙醇(1min)→伊红染液(1min)→95%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→二甲苯Ⅰ(2min)→二甲苯Ⅱ(2min)10.中性树胶封片(注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡)11.显微镜观察三实验样品四实验结果免疫荧光染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗，0.3%Triton x100，PBS等二实验步骤1.石蜡切片60℃烘片1小时2.脱蜡到水:二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)3.蒸馏水洗1min4.抗原修复：切片置于0.1mol/L且ph=6.0的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内（99℃）持续放10-15min，自然冷却20-30分钟（不能将切片拿出冷却）5.去除内源性酶：3%H2O2室温孵育5-10min6.PBS洗2-3次，每次5min7. 0.3%Triton x100室温孵育20min（增加细胞膜通透性）8.于室温湿盒内非特异血清封闭1h,(用DPBS稀释含10% goat FBS)9.孵育一抗(ITGB1)4℃过夜或37℃1h（一抗：DPBS(10% goat FBS)=1:200）,注意做空白对照（不加一抗，用DPBS(10% goat FBS)孵育）10. 孵育完成后PBS洗3次，每次5min11.滴加荧光二抗（IgG-FITC：DPBS(10% goat FBS)=1:200）室温置湿盒中避光孵育2小时或37℃30min，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS12.滴加DAPI 避光孵育2分钟（染核）。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤展开全文1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
免疫组化染色步骤
免疫组织化[检验原理]生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。
[试剂]1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂2:封闭用正常山羊血清工作液试剂3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂4:辣根酶标记链霉卵白素工作液[储存条件及有效期]2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。
使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。
[样本要求]1、标本类型:活检或手术切除标本。
2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。
固定时间以8~72小时为宜。
3、组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。
切片厚度3~ 5μm 黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。
[检验方法]1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。
3、操作程序:a) 脱蜡和水化石蜡切片置于新鲜二甲萃中，浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见抗说明书。
c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。
d)滴加封闭用正常山羊血清工作液滴加100uL或适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去血清，勿洗。
e)滴加一抗根据组织大小，滴加100pL或适量的抗，37*C孵育60分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次f) 滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔lgG滴加10uL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG,室温孵育10-15分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次。
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法)
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法) 免疫组织化学染色诊断是一种常用于病理学研究和临床诊断的技术，可以通过对组织切片中的特定抗原进行染色，来确定细胞或组织中的特定蛋白质分子的存在、分布和表达水平。
液盖膜涡流混匀法是一种常用的免疫组织化学染色方法，其基本步骤如下：
1. 组织标本的制备：取得需要检测的组织标本，经过处理后制备成切片。
2. 抗原解析：将切片进行抗原解析处理，使得目标蛋白质在切片上暴露出来。
3. 抗体处理：将特异性抗体添加到切片上，并进行孵育，使得抗体和目标蛋白质结合形成免疫复合物。
4. 二级抗体处理：添加与特异性抗体结合的二级抗体，并进行孵育，使得二级抗体与特异性抗体结合。
5. 染色处理：使用染色剂进行染色处理，使得免疫复合物能够被可视化。
6. 直接涡流混匀：将液盖膜盖在切片上，使用混匀仪进行混匀。
该方法主要优点是操作简便、染色效果较好、敏感性和特异性高等，适用于多种组织和细胞的检测。
1/ 1。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤1.取得组织标本：首先需要从患者或动物身上获得组织标本。
在手术过程中或尸检后，将组织标本取出并固定。
2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，常用的固定剂有10%的中性缓冲甲醛。
需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.嵌入和切片：将固定处理后的组织标本进行脱水和透明处理，然后用蜡块将其嵌入。
嵌入后的标本可以使用旋转式微切机进行切片，切片厚度通常为4-6微米。
4.脱蜡：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。
5.抗原检出：用特异性抗体结合试剂来检测组织中的特定抗原。
将切片在温床上恢复，然后用蛋白酶消化膜蛋白，以增强抗原的敏感性。
之后，使用特定的一抗（主抗体）与待检测的抗原结合，形成特异性抗原-抗体复合物。
6.二抗检出：使用特异性标记的二抗来检测抗原-抗体复合物。
通常，二抗为小鼠单克隆抗体，与抗体结合后，可通过酶标记法、光学染色或荧光染色等方法来检测二抗信号。
7.显色和镜检：通过给予染色剂，如DAB和H2O2溶液，产生可见的显色反应。
显色后的标本可以用显微镜进行观察和评估。
HE染色实验步骤：1.取得组织标本：与免疫组织化学实验类似，首先需要从患者或动物身上获得组织标本。
2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，使用10%的中性缓冲甲醛溶液进行固定。
需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.组织处理：将固定处理后的组织标本进行脱水，以至能够与石蜡亲和。
4.嵌入和切片：将脱水的组织标本注入熔化的石蜡中，以便于嵌入。
然后，使用旋转式微切机将嵌入后的标本切为薄片，厚度通常为4-6微米。
5. 脱蜡和染色：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。
接下来，将切片放入hematoxylin染色剂中，染出细胞核的蓝色。
6. 酸性染色：将切片转移到eosin染色剂中，以染出细胞质和胞外基质的红色。
7.脱水和渗透：将染色后的切片依次浸泡在动物级乙醇溶液中，然后放入橄榄油中进行清晰度处理。
炎症组织切片观察实验报告
炎症组织切片观察实验报告摘要：本实验旨在通过观察炎症组织切片，了解炎症反应的特征和变化。
实验采用了免疫组织化学染色技术，观察了炎症组织中不同细胞类型的分布和特征。
结果显示，炎症组织中出现了炎症细胞浸润、血管扩张和组织破坏等特征。
本实验结果对于炎症反应的机制研究和临床疾病诊断具有重要意义。
引言：炎症是机体对各种损伤刺激的非特异性反应，是一种复杂的生理和病理过程。
炎症反应的发生与机体免疫系统的激活密切相关，它是机体对抗感染和损伤的重要防御机制。
炎症反应的特征包括血管扩张、组织渗出、炎症细胞浸润和组织破坏等。
材料与方法：1. 实验动物：选择实验室小鼠作为实验动物，分为实验组和对照组。
2. 实验切片：采集炎症组织样本，制备切片。
3. 免疫组织化学染色：采用免疫组织化学染色技术，使用特定抗体标记不同细胞类型。
4. 显微镜观察：使用光学显微镜观察切片中不同细胞类型的分布和特征。
结果：实验结果显示，在炎症组织切片中，我们观察到了以下几个重要特征：1. 炎症细胞浸润：炎症组织切片中可见大量炎症细胞的浸润，主要包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等。
这些细胞通过血液循环进入炎症组织，对炎症反应起到重要作用。
2. 血管扩张：炎症组织切片中的血管明显扩张，血管壁变薄，血流速度加快。
这是由于炎症反应引起的血管内皮细胞收缩和通透性增加，导致血管扩张和渗出。
3. 组织渗出：炎症组织切片中可见大量的渗出细胞，包括炎症细胞和浆液性细胞。
渗出细胞是从血管内腔通过血管壁进入炎症组织的，它们参与了炎症反应的发生和发展。
4. 组织破坏：炎症组织切片中可见组织结构的破坏和细胞的坏死。
这是由于炎症反应引起的炎症细胞的释放的炎症介质对组织细胞的直接损伤。
讨论：通过观察炎症组织切片，我们可以更加全面地了解炎症反应的特征和变化。
炎症反应是机体对抗感染和损伤的重要防御机制，但过度或长期的炎症反应会导致组织损伤和疾病的发生。
因此，对炎症反应机制的研究具有重要意义。
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤免疫组织化学染色（IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法。
该技术广泛应用于医学研究和临床诊断中，可以帮助医生确定肿瘤类型、评估疾病进展和预测患者预后。
本文将介绍IHC的步骤和其原理。
IHC步骤：1. 取得组织样本：将需要检测的组织切片取出，并进行脱水、脱脂和固定处理。
2. 制备切片：将处理后的组织样本切成薄片，并将其放置在载玻片上。
3. 抗体染色：将需要检测的抗体与组织样本接触，使其结合。
4. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的抗体。
5. 二抗染色：将特异性二抗与已结合的第一抗体结合。
6. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的二抗。
7. 标记染色：将标记物与已结合的二抗结合，例如使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
8. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的标记物。
9. 显色：加入染色剂使标记物呈现颜色。
10. 封片：将切片加入封片剂中，封闭切片，并进行显微镜检查。
IHC原理：IHC的原理基于抗体-抗原结合反应。
当抗体与特定蛋白质结合时，可以使用二抗与已结合的第一抗体结合，二抗带有标记物，可以让我们对这些特定蛋白质进行检测。
标记物常用的有HRP、AP等，它们可以被染色剂显色使得特定蛋白质呈现颜色。
需要注意的是，IHC检测的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、染色剂的选择等。
因此，在进行IHC检测时需要进行严格的质量控制，确保结果的准确性和可靠性。
总结：免疫组织化学染色是一种广泛应用于医学研究和临床诊断中的技术。
通过对组织切片进行抗体染色和标记物显色，可以检测特定蛋白质的存在和表达情况。
IHC步骤包括取得组织样本、制备切片、抗体染色、洗涤、二抗染色、标记染色、洗涤、显色和封片。
IHC的原理基于抗体-抗原结合反应，检测结果受到多种因素的影响，需要进行严格的质量控制。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学（immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。
2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II各5min，再放入二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。
动物组织染色法
动物组织染色法动物组织染色法是一种常用的实验技术，用于观察和研究动物体内组织和细胞的结构、形态和功能。
通过染色，可以使细胞或组织的结构更加清晰可见，从而帮助科研人员对细胞和组织进行分析和研究。
一、常用的动物组织染色方法1. 常规染色法常规染色法是最常用的动物组织染色方法之一，主要用于观察细胞和组织的形态结构。
常用的染色剂包括伊红、苏木精、甲苯红等。
这些染色剂可以与细胞或组织中的特定成分结合，使其显色，从而使细胞和组织的结构更加明显。
2. 免疫组化染色法免疫组化染色法是一种利用特异性抗体与组织中的抗原结合的方法。
通过与特定抗原结合的抗体，科研人员可以检测和定位特定蛋白质在细胞和组织中的分布情况。
免疫组化染色法在癌症研究、免疫学研究等领域中得到广泛应用。
3. 原位杂交染色法原位杂交染色法是一种用于检测和定位特定核酸序列的方法。
通过与特定核酸序列互补的探针结合，可以在细胞和组织中检测到目标序列的存在。
原位杂交染色法在基因表达研究、遗传学研究等领域中具有重要意义。
二、动物组织染色的步骤1. 取材和固定首先需要取得动物组织样本，并将其迅速固定在适当的固定液中。
常用的固定液包括福尔马林、乙酸乙酯等。
固定的目的是保持组织的形态结构和化学成分，避免在后续处理过程中发生变化。
2. 脱水和清洁固定后的组织需要进行脱水处理，以去除其中的水分。
常用的脱水剂包括乙醇和丙酮等。
脱水后，还需要对组织进行清洁处理，以去除其中的脂肪和其他杂质。
3. 切片和染色脱水后的组织需要进行切片处理，制备出适当厚度的组织切片。
切片后，可以选择不同的染色方法进行染色。
常规染色需要将切片放入染色剂中浸泡一段时间，使其染色。
免疫组化染色和原位杂交染色需要在切片上加入特定抗体或探针，与目标结合后进行染色。
4. 封片和观察染色后的组织切片需要进行封片处理，以保护切片并增强显微镜下的观察效果。
封片可以使用透明胶片或封片胶进行。
封片后，可以使用显微镜观察组织切片，并进行分析和研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ICS65.020.30
B44
中国实验动物学会团体标准
T/CALAS x-201x
实验动物组织切片免疫组织化学染色
方法
Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin
embedded tissues
（征求意见稿）
201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。
本标准由中国实验动物学会归口。
本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。
本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。
本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。
本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
1范围
本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。
本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。
2术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
2.1
免疫组织化学immunohistochemistry,IHC
用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。
2.2
抗原antigen,Ag
一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。
2.3
抗体antibody
机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。
2.4
抗原修复antigen repair
利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。
3主要试剂
3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS）
先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠
（NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。
B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃
冰箱备用。
用时取A 液13ml，B 液87ml，用1N 氢氧化钠或盐酸调pH 至7.6,加蒸馏水至2000ml。
3.20.05M Tris-HCL 缓冲液(PH7.6)
取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N 盐酸溶液42ml，定容至100ml，于4℃冰箱保存。
临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M 缓冲液。
3.3柠檬酸抗原修复液
称取柠檬酸2.1g，加水至1000mL,用1N 盐酸调pH 至6.0。
3.4显色液
称取DAB 6mg 溶于10mL 0.05M Tris 缓冲液（pH7.6)中，然后加入0.1mL 0.3%过氧化氢(H 2O 2),此液需要现配现用。
4免疫组织化学方法（间接法）
4.1切片经二甲苯5min*2、无水乙醇5min*2、95％乙醇5min*2、85％乙醇5min、70％乙醇5min 完成脱蜡。
脱蜡后自来水洗5min。
4.20.3%H 2O 2甲醇处理切片20min。
4.3水洗。
4.4抗原修复。
4.5PBS 洗3次，2min/次。
4,6加入血清于湿盒中孵育20min。
4.7倾去血清，加入一抗于湿盒中孵育60min。
4.8PBS 洗3次，2min/次。
4.9加入二抗于湿盒中孵育30min。
4.10PBS 洗3次，2min/次。
4.11用含0.5%DAB，0.02%H 2O 2显色液孵育切片5-10min。
4.12PBS 洗，水洗。
4.13Mayer’s 苏木素染核1min。
4.14水洗1min，蓝化10min。
4.15切片再经70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各1min，经95％乙醇1min*2、无水乙醇2min*2快速脱水后用二甲苯透明5min，重复一次。
4.16根据盖玻片规格和载玻片上组织多少，滴加适量中性树胶，封片。
4.17以PBS 代替一抗为阴性对照。
5操作要求
5.1离体组织固定尽早固定，越新鲜越好，以防止组织自溶，抗原扩散。
5.2组织脱水应彻底干净。
组织块取材不宜太大过厚。
5.3切片应完整、均匀、平展、无皱褶。
5.4切片应烘烤附贴牢固。
5.5切片脱蜡应干净。
5.6应彻底抑制内源性过氧化物酶的活性。
5.7选择合适的抗体及对其作适当的保存和稀释才能取得较佳的实验效果。
一般使用与二抗相同动物来源的非免血清进行封闭。
5.8根据需要，在实验步骤中增加内源性生物素阻断步骤。
5.9正确冲洗PBS溶液。
6抗原修复方法
6.1微波抗原修复法：0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10min。
待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。
6.2高压抗原修复法：切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。
盖上压力阀至喷汽后持续3min,待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。
6.3水浴抗原修复法：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃）。
即开始计时，持续40min。
待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
6.4煮沸抗原修复法：将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度。
当达92℃后，即可拔离电源。
当温度低于92℃时，再插上电源。
如此反复持续至10min。
待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。
7结果判定
7.1阴性对照为阴性时，阳性反应产物呈淡黄色、棕黄色和褐黄色粗颗粒。
7.2依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。
依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性（+++，指阳性细胞总数在50%以上)。
对于免疫组织化学后切片的评判，要做到准确、客观。
应容易分辨出主要阳性细胞。
7.3对于
阳性细胞的阳性物定位要准确。
每批检测的切片，均应设阴性或空白对照片，以确保检测病例的准确性和可靠性。
对于具有明确检测抗原，可利用自身设立阳性对照片。
-------------------------。