8第八章原位杂交组织化学.pptx
合集下载
原位杂交组织化学
RNA检测必须注意的步骤 检测必须注意的步骤
不适宜高温的可用新鲜配制的DEPC在室温 不适宜高温的可用新鲜配制的DEPC在室温 DEPC 处理2 3h，再置于85℃条件℃条件下干燥1h，使 有毒的DEPC失活 有毒的DEPC失活 DEPC 所用试剂用DEPC水 终浓度0.05%-0.1%配 所用试剂用DEPC水，终浓度0.05%-0.1%配 试剂用DEPC 0.05% 配好后室温处理过夜或室温搅拌20min 20min， 制，配好后室温处理过夜或室温搅拌20min， 然后高压消毒 所用操作都要带手套 所用操作都要带手套
发展简史
1969年 美国Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探 1969年，美国Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探 Gall 针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于核仁， 基因定位于核仁 针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于核仁，从而 创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞， 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均 采用同位素标记。 采用同位素标记。 同位素标记 同位素标记缺点：污染环境，有害人体， 同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局限 性
DNA和RNA的区别 DNA和RNA的区别
DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。 常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或 细胞内的DNA原位杂交 细胞内的DNA原位杂交 DNA RNA：RNA酶几乎无处不在， RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的 消毒方法不能将其灭活。因此，当检测 消毒方法不能将其灭活。因此， RNA或用RNA作为探针时， RNA或用RNA作为探针时，从标本准备到 或用RNA作为探针时 杂交结束前， 杂交结束前，都要注意预防
原位杂交技术ppt课件
探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
分类
1、 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作 封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术
3 、多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。
4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过 PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数 增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定 位和定量分析。
1、标记物
①高度灵敏性； ②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模
板的结合能力及结合的特异性； ③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多
大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活 性； ④高度特异性； ⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单 ； ⑥对环境无污染，对人体无损伤； ⑦价格低廉等。
荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。
分类
1、 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作 封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术
3 、多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。
4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过 PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数 增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定 位和定量分析。
1、标记物
①高度灵敏性； ②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模
板的结合能力及结合的特异性； ③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多
大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活 性； ④高度特异性； ⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单 ； ⑥对环境无污染，对人体无损伤； ⑦价格低廉等。
荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。
原位杂交操作流程PPT参考幻灯片
D.W. →
500ml
封闭；0.5%抗体阻断液 in BufferⅠ（含0.2%Tween20）
37℃ 20 min
抗体阻断液 :
(1:500抗地高辛抗体 in 阻断液 37℃ 2 h)
阻断剂
1g
Tween-20 0.4ml
BufferⅠ 37℃ 10 min×2
BufferⅠ 200ml
BufferⅡ 37℃ 10 min×2
杂交后处理
2×SSC脱去盖膜（片） 50℃
2×SSC清洗 37℃ 10 min×2
20μg/mlRNaseA in Rnsae buffer 37℃ 30 min
Rnase buffer 37℃ 30 min
Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W→ 1000ml
450ml
加热（60℃、20min）溶解
冷却后调pH至7.4
1×PBS → 500ml
PBS RT 5 min×2
10×PBS：500ml
NaCl
40g
KCl
1g
KH2PO4
1g
Na2HPO4 7.7g
DEPC水 450ml
调Ph至7.5 DEPC水加至500ml
PBS(含0.3%v/vTritonX-100) RT 15 min
临用前配制
10%TritonX-100 15ml
1×PBS → 500ml
PBS RT 5min ×2 2
消化： 2μg/mlProteinase K in TE buffer 37℃ 10 min
TE：
pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml
原位杂交组织化学课件
Maturation Promoting Factor, MPF
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第一节 原位杂交组织化学基本原理
变性 变性温度（Tm） 复性
酯键
共价键
James Watson and Francis Crick (Cambridge) discover the structure of DNA.
最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双 链DNA或单链DNA探针
cDNA探针
互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而 产生的
优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
cRNA探针
以cDNA为模板在体外转录而成的探针
缺点 制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件， cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中 需严格防止RNA酶污染。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定 长度的寡核苷酸片段。
探针标记方法
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
低离子强度，Tm低 高pH 变性剂甲酰胺
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
复性（renaturation）
指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的 多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋 结构
复性的影响因素
温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
原位杂交技术ppt课件
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
原位杂交讲义
核酸探针
(二)cRNA探针
改变外源cDNA的插入方向，或选用不同的 RNA聚合酶，以控制RNA的转录方向 反义RNA探针( antisense probe)： 与mRNA互补， cRNA探针 同义RNA探针(sense probe)： 与mRNA同序列，阴性对照
提供有标记物标记的核苷酸原料，转录 的同时对探针进行标记
原位杂交组织化学
河北医科大学 基 础 医 学 院
组织胚胎学室
定 义
原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry) 简称原位杂交(in situ hybridization): 分子生物学与组织化学相结合 利用核酸探针 与组织细胞中待测核酸按碱基配 对的原则在原位特异性结合形成杂交体，通过组织化 学或免疫细胞化学显示或检测标记物，在原位检测细 胞内核酸 (DNA, mRNA)
32P、3H、35S
非放射性标记物 HRP、AKP、地高辛、 生物素、荧光素 稳定，分辨率高，操作 简便，检测时间短，无 放射污染 敏感性较低，难以定量
标记探针易于掺入核酸 分子，标记反应易监测， 敏感性高，易于半定量
缺
点
辐射危害，有半衰期限 制 ，分辨率较低，检测 时间长
双链DNA 探针的缺口平移法标记
转录 翻译
基因表达：DNA
mRNA
蛋白质
核酸分子杂交概述
定义
简称分子杂交(molecular hybridization), 在一定条件下，两条来源不同但其碱基 互补的核酸单链按碱基配对原则形成杂合双 链的过程 DNA变性-复性 DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA
原理
杂交体的稳定性
RNA的功能
原位杂交组织化学幻灯片PPT
当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双 链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降 或pH恢复到中性（复性），单链会按照碱基互补配 对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。 无论两条单链来源是否相同，只要它们之间的碱基 顺序互补或者部分互补，在条件适宜时，就可以全 部或部分复性，产生分子杂交重和多重原位杂交技术
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
原位杂交组织化学
D ATA S HEETwww .tbdscience .com 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司◆TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD236# Baidi Road Nankai District Tianjin ◆ 300192 P .R ChinaTel: 86-22-60524017 ◆ Fax: 86-22-87893403 87894017 ◆ QQ:387745440 35441562Product InformationProduct Name: 人 13号染色体 DNA FISH 原位杂交染色系统 实验方法Product Number: FISH200813#Store at: 4° C Size : 100T1 寡核苷酸探针预杂交液 既用型 Product Number:FISH002 2ml 2 寡核苷酸探针杂交液 既用型 Product Number:FISH001 2ml3 复合消化液 (P/E)PH:6.4 既用型 Product Number:TSP6044 6ml 4 50%去离子甲酰氨 10ml5 2 X SSC 干粉 2000ml6 硫氰酸钠溶液：16g 硫氰酸钠溶于200mL 的蒸馏水。
10ml7 细胞打孔液 10ml8 13#染色人体 荧光探针 干粉 30ug （探针的配制：去离子水100ul ，溶解30ugSRY 探针，分装5支管，每管6ug/20ul 。
-20度冻存，可长期保存，避免反复冻融。
临用前取一支分装好的探针，加入1ml 探针稀释液37度10分钟混匀，即为-6ug/ml 的即用型探针杂交液。
）13号染色体 FISH 荧光原位杂交基本的实验方法。
（基因组DNA ）基因组DNA 荧光探针染色步骤 石蜡切片的复水 梯度乙醇复水：用纯水配制95%-80%-60%-30%的梯度乙醇（3-5分钟/次）。
第八章原位杂交组织化学
3、杂交（Hybridisation）
在ISHH，整个实验周期是比较长的， 实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH整 个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。
杂交前的一切准备工作如增加组织通 透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针 能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结 合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是 最重要的一个环节。
与此同时， Buongiorno– Nardelli和 Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记 核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而 创造了原位 杂交细胞或组织化学技术。
• 1970年 Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行 杂交，首次用原位杂交检测了病毒 DNA在细 胞中的定位。
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、 切片的厚度和核酸探针的长度而定。
例如：用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生 广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透 性的试剂。
增强组织通透性的常用方法：如应用稀释的 酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂 Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白 酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。
二、原位杂交组织化学基本技术
• 由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应 用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应 用原则大致相同。大致可分为： ① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织 的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景 染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）：包括放射性自显影和 非放射性标记的显色。
（二）原位杂交技术的发展
由于同位素标记探针具有放射性既污 染环境，又对人体有害，且受半衰期限制 等缺点，科学工作者们开始探索用非放射 性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。
原位分子杂交组织化学详解演示文稿
3）去污剂：增加组织通透性，利于探针进入 0.01%-0.3% Triton X-100 15min
4）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露 蛋白酶K、链酶蛋白酶、胃蛋白酶 1ug/ml蛋白酶K ，37℃，15-30min
5）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位点
3.防止RNA
由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶,为 防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴 消毒手套.所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日 置高温(160℃)烘烤以达到消除RNA酶的目的.要破坏
末端标记法
原理：将标记物导入线性DNA或RNA的5’端或3’端 的一类
标记方法。主要分为： 5’末端标记法，3’末端标记 法，T4聚合酶替代法。
五、ISHH基本程序（以检测组织 细胞内的mRNA为例）
(一）杂交前处理
• 玻片预处理（灭活Rnase)
• 切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）
1.玻片预处理（灭活Rnase)
原位分子杂交组织化学详解演 示文稿
优选原位分子杂交组织化学
二、原位杂交的基本原理
三、原位杂交组织化学技术的应用
• 1.细胞特异性mRNA转录的定位；
• 2.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水 平的表达
• 及其变化的研究；
• 3.病原微生物检测；
• 4. 基因在染色体上的定位；
• 5. 检测染色体的变化；
放射性标记物一般为125I 、35S或32P；
非放射性标记有生物素或地高辛的间接标 记，也有FITC或者罗丹明对探针分子的 直接标记。
探针标记方法比较
1. 敏感性：放射性探针＞地高辛探针＞生物素探 针
2. 对人危害性：放射性探针、生物素探针 3. 放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。 4. 生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；
原位杂交
杂交温度选择 条件：杂交液中甲酰胺浓度 50％ Na＋浓度 0.75mol DNA探针 RNA探针 42℃ 左右 50～55℃ 左右
寡核苷酸探针 37℃
注意：依据具体情况摸索确定最佳杂交温度
杂交严格度
决定探针能否与不相配碱基结合而形成杂交体的条件 即杂交体双链间碱基配对程度，直接影响杂交的稳定性 影响杂交稳定性的因素决定着杂交条件的严格度 甲酰胺浓度、杂交温度、单价离子（Na＋）浓度等 高严格度：高甲酰胺浓度、低温和高离子强度 碱基错配率低，杂交反应特异性强 严格度可以通过杂交反应及杂交后漂洗过程来控制 有人认为：高严格度的杂交，保证杂交反应的特异性
双链或单链cDNA 和cRNA探针 16h以上（过夜孵育） 但不超过24h，只有少数杂交反应达40h
4. 杂交温度
杂交的基本条件：探针与靶核苷酸为单链（即变性、解链）
杂交体解链的温度为解链温度（Tm） Tm 指使50％的核苷酸变性解链所需的温度 多数的双链DNA探针 90℃ 多数的RNA探针 95℃
HRP-AEC AlP－New fuchsin
对照实验的设臵
保障实验结果的准确性和特异性 分为阳性对照、阴性对照两类 如：标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照 阴性对照 排除非特异性杂交等因素造成的假阳性 阳性对照 证明杂交步骤及试剂可靠性
理论而言，对照实验设臵愈多，实验结果的可靠性就愈大。 实际工作中，因实验室条件的限制，很难同时实施多种对 照实验。 注意 每次实验都应有阳性对照和阴性对照
3. 探针浓度和杂交时间
探针浓度 探针浓度的高低将直接影响着杂交反应的速度 探针浓度增加，杂交率增加 高浓度的探针会带来较高的背景着色
Cox等检测探针浓度对杂交信号的影响 探针浓度小于2µg/ml，探针浓度与杂交信号成直线增长 超过2µg/ml，杂交信号不增加，但背景色增高
免疫组化与原位杂交ppt课件
显色特点：
---紫色
---不溶于水但溶于脂类溶剂
---容易扩散
---不能永久保存
完整最新ppt
5
2）快红（固红/萘酚磷酸盐，Fast Red TR/Naphthol AS-MX）
显色特点： ---桃红色---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存
3）快蓝（固蓝BB/萘酚磷酸盐，Fast Blue BB/Naphthol ASMX)
显色特点： ---蓝色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存
4）品红（品红/萘酚磷酸盐，完整F最u新cphpst in/Naphthol AS-TR） 6
显色特点：
---红色 ---不溶于水及脂类溶剂 ---不扩散 ---永久保存
DAB
Fast blue
AEC
Fast red
PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和 赖
氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。
2.固定方法：必须用预冷（4℃）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间。
免疫组织化学和原位杂交
Immunohistochemistry & In situ hybridization
完整最新ppt
1
免疫组织化学
前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。
一、基本原理 ：
利用 抗体（antibody）与 相应抗原（antigen）的特 异性结合, 通过与抗体连接 的酶反应或荧光染料显示 抗原所在的位置。
四）胶体金（colloidal gold）
又称金溶胶（gold solution），是指分
散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶，
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
❖ RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降 解减少到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时 间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
❖ 固定剂：
多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s 液
优缺点： 沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液
直接法、间接法
一 原位杂交的由来与发展
（一）核酸分子杂交技术
❖ 按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 ❖ 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④ 复性速率液相分子杂交
❖ 固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用 的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔 板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。
第八章 原位杂交组织化学
原位杂交组织化学（ISHH）
原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核
酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同--
DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交 根据探针标记物是否直接被检测—
（2）探针的长度
最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。 200～500个碱基的探针--- 可应用. 超过500个碱基的探针--- 在杂交前最好用碱或水解酶进
能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质
产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。 多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或 保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。 如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂 交结果。
放射性自显影显色、非放射性标记显色
（一）原位杂交的基本要求
1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理 5 显示 6 对照实验和ISHH结果的判断
1 固定
固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。
❖ DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的 种类和浓度并不十分重要。
减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵育 时间上应慎为掌握。
（3）减低背景染色
❖ 预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的
区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入 预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减 低背景染色。 ❖ 杂交后洗涤:
固相杂交技术包括： ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交 ④ Northern印迹杂交 ⑤ 组织原位杂交
（二）原位杂交技术的发展
在近20年飞跃发展的突出特点： ① 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； ② 探针生产的可靠性和速率大大发展了； ③ 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规
❖ 病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标 本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。
❖ 石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响 核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时， 在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
❖ 冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片 也可获得满意效果。
2 玻片和组织切片的处理
（1）玻片的处理 热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净 烘干
95%酒精中浸泡24h 蒸馏水冲洗 烘干
烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶 盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长 度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或 某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交 信号. 缺点:
3 杂交（Hybridisation）
杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。 是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。 加盖片的目的 防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。Байду номын сангаас
技术和临床日常应用的诊断技术。 ④ 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。
二 原位杂交组织化学基本技术
❖ 原位杂交的基本方法和应用原则：
① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理， 如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）：
杂交注意环节
（1）探针的浓度 原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。
杂交液的量要适当: 以10～20μl/每张切片为宜。 杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。
采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去 除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。
（4）防止RNA酶的污染
① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。 ② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘 烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。 ③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。
❖ 固定剂：
多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s 液
优缺点： 沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液
直接法、间接法
一 原位杂交的由来与发展
（一）核酸分子杂交技术
❖ 按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 ❖ 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④ 复性速率液相分子杂交
❖ 固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用 的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔 板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。
第八章 原位杂交组织化学
原位杂交组织化学（ISHH）
原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核
酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同--
DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交 根据探针标记物是否直接被检测—
（2）探针的长度
最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。 200～500个碱基的探针--- 可应用. 超过500个碱基的探针--- 在杂交前最好用碱或水解酶进
能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质
产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。 多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或 保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。 如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂 交结果。
放射性自显影显色、非放射性标记显色
（一）原位杂交的基本要求
1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理 5 显示 6 对照实验和ISHH结果的判断
1 固定
固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。
❖ DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的 种类和浓度并不十分重要。
减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵育 时间上应慎为掌握。
（3）减低背景染色
❖ 预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的
区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入 预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减 低背景染色。 ❖ 杂交后洗涤:
固相杂交技术包括： ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交 ④ Northern印迹杂交 ⑤ 组织原位杂交
（二）原位杂交技术的发展
在近20年飞跃发展的突出特点： ① 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； ② 探针生产的可靠性和速率大大发展了； ③ 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规
❖ 病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标 本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。
❖ 石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响 核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时， 在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
❖ 冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片 也可获得满意效果。
2 玻片和组织切片的处理
（1）玻片的处理 热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净 烘干
95%酒精中浸泡24h 蒸馏水冲洗 烘干
烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶 盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长 度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或 某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交 信号. 缺点:
3 杂交（Hybridisation）
杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。 是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。 加盖片的目的 防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。Байду номын сангаас
技术和临床日常应用的诊断技术。 ④ 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。
二 原位杂交组织化学基本技术
❖ 原位杂交的基本方法和应用原则：
① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理， 如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）：
杂交注意环节
（1）探针的浓度 原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。
杂交液的量要适当: 以10～20μl/每张切片为宜。 杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。
采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去 除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。
（4）防止RNA酶的污染
① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。 ② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘 烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。 ③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。