核酸的定量分析方法

荧 光 分 析 法
2.金属离子（荧光探针）
荧
光
主要是基于某些稀土离子本身的发光特点。稀土离子的共振
分
带正好与核酸受紫外光激发时的三线态相重叠，能有效的发生
析
从有机配体到中心离子之间的能量转移，与DNA作用后可产生特
法
征荧光，荧光强度的增强在一定范围内与DNA的浓度成正比，可
用于测定DNA的含量。
加入Co(Ⅱ)后荧光增强，说明槲皮素与Co(Ⅱ)形成二元配合物，在此体系中
加入ctDNA后，荧光再次增强。槲皮素与DNA二元体系无此现象，说明槲皮
素、Co(Ⅱ)、DNA形成了三元配合物。
荧 光 分 析 法
4.基于荧光猝灭测定DNA
荧 光 发光剂：10, 10′-二乙基- 2,2′-
二磺酸基双吖啶(DEDSBA)
荧
移，在体系中AO作为荧光能量的给予体，而ST则是能量的接受体。
光
当有DNA存在时，AO-DNA体系的荧光强度被ST淬灭的程度大大 增加。
分
析
法
1.AO荧光发射光谱 2.ST 电子吸收光谱
DNA的存在前后，ST对AO荧光淬灭的变化主要是由于DNA分子对AO 分子、ST分子的极化作用引起。ST对AO-DNA荧光淬灭的效率大于AO荧 光淬灭效率，是由于DNA对AO与ST间的荧光能量转移过程促进的影响。
核酸的定量分析
1
定磷法
2
紫外吸收法
3
荧光光度法
4
共振光散射法
5
电化学法
核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA
定
及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为
磷
9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11
法
倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依
L： 比色皿的厚度
当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷 酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核 酸，测定上清液260nm 处吸光值作为对照。
紫
外
吸
核酸样品
收
（酸溶性核 苷酸或可透
法
析的低聚多
核苷酸）
A：蒸馏水 （空白）
混 水浴10min 匀
离心10min 取上清液定容稀释
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
质的研究中，而必须引入荧光探针。荧光衍生法为研究核酸提供了灵
敏探针，但方法繁琐、操作费时。
电
电化学方法在DNA和RNA的分析中起着重要。
化
研究人员发现DNA的加入使pharmorubicin（表阿霉素）的
学
阳极峰电流明显减小，降低程度与DNA浓度呈良好线性关系。
法
据此建立了测定DNA的电化学分析方法。具有灵敏、快速、
荧 光
由于 DNA 本身荧光很弱，因此不能利用荧光光度法直接测定 DNA 含量，当某些小分子探针与 DNA 结合后，荧光强度会大大
分 增强，而有一些小分子与 DNA结合后，会引起溶液的荧光猝灭
析 作用。基于这些现象，可用荧光光度法测定 DNA的含量。
法
1.荧光染料（荧光探针）
荧
主要是基于嵌入核酸碱基对中，发生共振能量转移导致荧光强度
外
的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右。常利用核酸的紫外吸收性
吸
进行核酸的定量测定。
收
核酸、核苷酸的摩尔消光系数用ε(P)表示，为每升溶液中含有1摩
法
尔原子磷的光吸收值。RNA的ε(P)260nm（pH7.0）为7700～7800， RNA的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1ug RNA的光吸收值相当于
紫外分光光度计 上测定 260nm处吸光度
B：钼酸铵-过 氯酸沉淀剂
紫
RNA（或DNA）的质量浓度（ mg/L)
A 260nm
稀释倍数
0.024(0.02 0) L
外
吸 收
A260nm ——A管稀释液在260nm波长处的吸光度减去B
管稀释液在260nm波长处的吸光度
法
核酸的质量分数＝ 待测待液测中液测中得制的品核的酸质质量（量（g）g）100 %
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
法
0.020 L
A260：260nm处吸光度值读数 0.024：每毫升溶液内含一微克RNA的吸光度 0.020：每毫升溶液内含一微克DNA钠盐时的吸光度
据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。
钼酸盐 （定磷试剂）
含磷有机 物
硫酸或过氯酸消化
无机磷 （酸性条件）
定 磷
磷钼酸盐络合 物
还原剂： 黄色物质 变为蓝黑 色
法
吸收值与 磷含量成
660nm处 有最大光
分光光度计
钼蓝
正比
吸收峰
生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有
机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化
定
只要从核酸样品中测得磷的含量即可推算出核酸含量。定磷法
机 理
准确度好,灵敏线度性高,常作为其它方法的基准。但是核酸样品中原 有机无磷机。磷杂质关对系测定有影响号,测瑞增利定强散时射要信注意扣除核酸（复体样合积品物增中离大子的） 无
三芳甲烷类染料
（1）核酸某些碱性三苯甲烷染料体系的RRS及其分析应用
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
Ce(III)的 各种阳离
子型体
静电作用
荧光猝灭
猝灭程度与ＤＮＡ 浓度呈线性关系
分
析
法
0~6.0×10-6 g/ml 3.0×10-6~8.0×10-
小牛胸腺
6g/ml
(ct)DNA
上的磷酸
根
荧 光 分 析 法
激发
发射
光谱特征
3.金属络合物（荧光探针）
荧
光
多是过渡金属元素络合物，主要是基于络合物立体结构的发光
分
性质。测定中离子强度过高会影响DNA的构象，使DNA表面的阴
析
离子被屏蔽，降低核酸分子竞争阳离子的能力。酸度过低会使核
法
酸中磷酸根质子化，而过高可能会出现金属的难溶物。另外有时
蛋白质的存在会严重干扰测定，须预先去除再进行测定。
槲皮素-钴(Ⅱ)-核酸三元配合物荧光法测定核酸
荧
槲皮素
（微弱荧光）
光
分
0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P) 260nm（pH7.0）为6600，含
磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1ug DNA钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当待测的核酸样品中不含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核 苷酸，既可将样品配制成一定浓度的核酸溶液（20-50ug/ml）, 在紫外分光光度计上直接测定。
mol/L
相关系数：r= 0.9924
线性范围： 8.5×10-9～ 3.5×10-8
mol/L
相关系数：r= 0.9997
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的 生物传感器
电
化
学
DNA生物传感器就是一种全新的思路和尝试，与传统的监测技
法
术相比，传感器具有快速、灵敏、操作和仪器设备简单的特点，
荧 光 分 析 法
荧 光 分 析 法
2.AO-ST-DNA体系荧光能量转移
荧
光
在DNA存在时，AO的荧光被ST淬灭的效率大，DNA的存在，使
分
AO-ST之间的荧光能量转移效率增加。说明对NDA的定量分析的
析
荧光光谱探针就是AO-ST之间的有效能量转移，利用DNA对AO-ST
法
体系能量转移影响程度和DNA浓度的线性关系。
射
同，电子因共振而强烈吸收光的能量发生再次散射，
法
其散射强度能比单纯的瑞利散射提高几个数量级，
这种现象被称为共振瑞利散射。
近年来，共振光散射法作为一种高灵敏度的分析测试技术在临床分析、
生化分析、痕量金属的测定中得到了广泛的研究和应用。共振光散射
共
振
的分析应用主要集中于两方面：
能对光辐射产生吸收， 具有跃迁的的不饱和
并具有分子识别功能，代表当今生物检测技术的前沿。该方法
测量灵敏度高，能很好地识别转基因食品中的特异DNA序列。
指一束光通过介质时，在入射光方向以 外的各方向观察到的一种光辐射现象。
共
振 瑞
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
光散射粒子的尺度远小于入射光波长时， 称为瑞利散射（RS）。
利
当瑞利散射位于或接近于散射分子
散
吸收带时，由于电子吸收电磁波频率与散射频率相
紫
紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达
外
3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高
吸
峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，
收
因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
法
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋 白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染物），则测定误差较大，应设法 除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
ssDNA电极杂交 （含一定浓度目 的基因杂交液 SSC）
电
化
DNA传感器 （ssDNA通
学
过生物素-亲 和素的方法
法
固载在Pt电 极）
指示剂： Co(phen)33+
工作电极
DNA序列 检测系统
示差脉冲伏 安法(DPV)
电 流 变 化
方波 伏安法(AWV)
线性范围： 8.0×10-9～ 2.8× 10-8
氯化钠介质中小牛胸腺脱氧核糖核酸对铈的
荧光碎灭机理
荧
光
分
Ce(III)具有其独特的荧光性质，在弱酸性的NaCI介质中Ce(III)
析
的荧光被小牛胸腺脱氧核糖核酸(ctDNA)所碎灭，其碎灭机理是
法
Ce(III)的各种阳离子型体与ctDNA上的磷酸根阴离子之间的静电
作用。
荧 光
Ce(III)受254.0nm紫外光激 发在350.0nm处产生荧光
瑞
基团
利
（1）利用生色团在生物大分子上的聚集作用导致共振光散射强度的增
散
强，对蛋白质、核酸等生物大分子进行定量测定。
射
法
（2）利用某些离子缔合物会产生强烈的共振光散射强度，对痕量金属、
非金属以及某些有机物进行定量测定。
1.有机染料作为共振光散射探针
定磷法
测
有机染料
核酸
静电引力
核酸中含磷量与核酸含量成正比,DNA为9.2%,RNA为8.5-9.0%。
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
光
的增强或减弱来进行测定。一些荧光染料体系与DNA结合后,光谱呈
分
现出能量转移特征，引起荧光增强或减弱，即敏化荧光和荧光猝灭
析 法
现象。能量转移的形式是单重态-单重态转移，由一个发荧光的给体
将能量传给一个受体。
吖啶橙(AO)-藏红T(ST)荧光探针测定DNA的研究
荧
吖啶橙(AO)：能量给予体 藏红T(ST)：能量接受体
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
分 析 法
DNA
pH= 8.5的BrittonRobinson缓冲液
浓度与荧光强 度成线性关系
线性范围 1.0～ 10.0mg/ L
检测限 0.46mg/ L
荧 • 荧光分析法灵敏度高、选择性好、操作方便，在生物分析中有非常广
光
泛的应用。
分
析
法 • 由于核酸内源荧光很弱，无法将荧光技术直接应用于核酸结构和性
析
钴(Ⅱ)
法
热变性小牛 胸腺DNA
激发波长334 nm 发射波长470 nm
线性范围 0. 4× 10-5～ 3. 0× 10-5mol/L
检测限 6×10-7 mol/L
线性相关系数： 0.9990
荧
光
a.槲皮素
分
b.槲皮素+ Co(Ⅱ)
析
c.槲皮素+ Co(Ⅱ)+ DNA
法
实验结果表明470 nm处，Co和ctDNA均无荧光，而槲皮素有微弱荧光，
研
碱性三苯甲烷染料(BTPMD)包括乙基紫(Ethyl Violet， EV)、结晶 紫(Crystal Violet，CV)、甲基紫(MethylViolet，MV)、孔雀石绿
究 (Malachite Green，MG)、亮绿(BrillantGreen，BG)、甲基绿(Methyl
进 展
Green，MeG)和碘绿(Iodine Green，IG)，它们具有相似的结构，在 水溶液中以 离子形式存在。