核酸的定量分析方法
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸定量的常用方法
核酸定量的常用方法、原理、优缺点等。
紫外分光光度法：利用核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外光的照射下在260nm处有最大吸收峰的原理对核酸进行定量和定性的方法。
是实验室内较为常用的方法。
优点：操作简单，设备要求低。
缺点：灵敏度不够高，只能测定总核酸量，不能区分核算种类；易受样品中其他杂质的干扰（如pH值、残留的提取剂等）。
荧光染料法：基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。
常用的荧光染料有嗅化乙锭、SYBR系列染料等。
优点：灵敏度高，所需样品量少，可重复性高。
缺点：染料一般都含有较高毒性，检测结果受染料与核酸的结合率影响。
实时荧光定量PCR法：在反应体系内加入荧光基团，通过荧光基团发出荧光信号经积累来实时检测PCR的反应过程，最后通过相对定量或者绝对定量的方法对未知浓度的核酸进行定量分析。
常用的检测方法有TaqMan探针和荧光染料两种。
TaqMan探针法：利用Taqman酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针，分别标记有荧光信号基团R和淬灭基团Q，当二者都存在的时候R基团受Q基团影响不发出荧光信号，而在PCR反应过程中，聚合酶将探针的碱基水解，R 与Q基团分离，R基团发出荧光信号，模板每扩增一次，就产生一次荧光信号，通过对荧光信号的检测和绘制荧光信号曲线，与标准曲线对比分析，可对核酸进行定量。
优点是特异性强，缺点是探针序列设计时需要强特异性，以及成本相对较高。
DNA结合荧光染料法：常用的荧光染料为SYBR Green Ⅰ，该技术通过在PCR 反应体系中加入过量的荧光染料，染料会特异性的与dsDNA结合并发出荧光信号，而未与dsDNA结合的不会发出荧光信号，在PCR过程中仪器通过检测荧光信号增强的曲线图，与标准品进行对比分析进行核酸定量。
优点是成本相对于Taqman探针法较低，可以做熔解曲线了解引物的Tm值，缺点是染料能与非特异性的dsDNA结合对实验结果产生干扰。
核酸含量测定(精)
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
核酸的定量测定.
3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英 比色杯，在260nm波长处测定A值。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
1. 取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确 地加入各试剂。
编号
标准磷溶液 10ug/mL(mL)
1 0.00
水(mL)
3.00
定磷试剂
3.00
消化的RNA(0.06mg/ml)
未消化的 RNA(0.06mg/ml)
0.00 0.00
2
0.20 2.80 3.00 0.00
0.00
3
0.40 2.60 3.00 0.00
核酸的定量测定
紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法
紫外吸收法 实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸 的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA 片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于 RNA分析时不会分解样品。
定磷法
二、实验原理
1. 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼 酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸， 当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝。
核酸的定量分析方法
其他比值法
总结词
除了染料法和酶法之外，还有一些其他的比值法用于 核酸的定量分析。
详细描述
这些方法包括荧光定量PCR法、基因芯片法、数字 PCR法等。荧光定量PCR法是一种实时定量PCR技术 ，通过在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的 积累与核酸浓度之间的线性关系来实现对核酸的定量 分析
06
基于荧光染料的方法
。
优点
简单易行，对样品预处理要求 较低，定量准确度高。
荧光光谱法
原理
荧光光谱法是通过特定波长的激发光激发核酸分子中的荧光基团，产生荧光信号，通过测量荧光信号的强度，对核酸进行定 量分析。
应用范围
该方法主要应用于低浓度核酸样品的定量分析，如基因芯片、蛋白质芯片等。
优点
灵敏度高，可实现多通道检测，特异性较强。
应用
核酸质谱法在基因突变筛查、基因表达差异分析、基因测序 等方面有广泛的应用。
基质辅助激光解吸/电离质谱
原理
基质辅助激光解吸/电离质谱是一种将样品固定在某种基质上，再用激光束照 射，使样品瞬间气化并离子化的方法。
应用
基质辅助激光解吸/电离质谱在蛋白质组学、代谢组学、生物医药等领域有广 泛的应用。
同位素标记法
原子光谱法
01
02
03
原理
原子光谱法是通过原子能 级跃迁时吸收或发射特定 波长的光，对核酸中的元 素进行定量分析。
应用范围
该方法主要应用于分析核 酸中的元素种类和含量， 如P、S等。
优点
可同时检测多种元素，灵 敏度高，精密度高。
04
基于质谱的方法
核酸质谱法
原理
核酸质谱法利用质谱技术，将核酸分子离子化并分离出不同 质量的离子，从而实现对核酸的定量分析。
核酸的定量分析方法
将样品放入核磁共振谱仪中，通过调节磁场强度和射频 脉冲的频率和幅度，获取样品的一维核磁共振谱图。
方法优缺点
优点是无需进行化学反应，对样品无损伤；缺点是对仪 器要求较高，谱图解析较为复杂。
THANK YOU.
在MALDI-TOF MS中，样品分子与基质分子混合 后，通过激光束照射基质分子，使样品分子离子 化并解吸进入气相。
MALDI-TOF MS具有高灵敏度、高分辨率和高通 量等优点，可广泛应用于蛋白质、核酸等生物分 子的分析鉴定，如用于蛋白质组学研究、DNA测 序和定量分析等。
06
基于核磁共振的定量分析方 法
核磁共振的基本原理
01
核磁共振现象
原子核在磁场中进行旋转，当磁场发生变化时，原子核吸收能量并发
生跃迁，产生核磁共振信号。
02
原子核自旋
原子核具有自旋角动量，在外加磁场中会产生磁矩，导致原子核在磁
场中进行旋转。
03
核磁共振条件
原子核只有在磁场发生变化时才会发生核磁共振，变化的磁场可以是
静磁场或梯度磁场。
02
基于染料结合的方 法
该方法利用荧光染料或溴化乙锭等 染料与DNA结合形成复合物，通过 测量染料-DNA复合物的荧光信号 强度来定量核酸。该方法包括荧光 染料结合法和荧光光谱法等。
基于标准品比较的 方法
该方法通过与已知浓度的标准品 进行比较，推算未知样品的浓度
04
基于生物传感器的 方法
该方法利用生物传感器对核酸进行 定性和定量分析
定量分析指导实验设计
通过对核酸进行定量分析，可以了解特定实验条件下细胞或 生物体内核酸的含量，指导实验设计、功能研究及临床诊断 等。
核酸定量分析的方法分类
核酸的定量测定.
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的 核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（ 地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜 绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光 吸收。
2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
核酸的定量分析方法
优
点
紫
紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达
外
3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高
吸
峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，
收
因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
法
缺
点 若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋
ssDNA电极杂交 （含一定浓度目 的基因杂交液 SSC）
电
化
DNA传感器 （ssDNA通
学
过生物素-亲 和素的方法
法
固载在Pt电 极）
指示剂： Co(phen)33+
工作电极
DNA序列 检测系统
示差脉冲伏 安法(DPV)
电 流 变 化
方波 伏安法(AWV)
线性范围： 8.0×10-9～ 2.8× 10-8
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
荧
移，在体系中AO作为荧光能量的给予体，而ST则是能量的接受体。
光
当有DNA存在时，AO-DNA体系的荧光强度被ST淬灭的程度大大 增加。
分
析
法
1.AO荧光发射光谱 2.ST 电子吸收光谱
DNA的存在前后，ST对AO荧光淬灭的变化主要是由于DNA分子对AO 分子、ST分子的极化作用引起。ST对AO-DNA荧光淬灭的效率大于AO荧 光淬灭效率，是由于DNA对AO与ST间的荧光能量转移过程促进的影响。
B：钼酸铵-过 氯酸沉淀剂
紫
RNA（或DNA）的质量浓度（mg/L)
A 260nm
稀释倍数
0.024(0.020) L
外
吸 收
核酸的定量分析方法
核酸的定量分析方法核酸的定量分析方法主要包括吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR等。
这些方法具有灵敏度高、选择性好和操作简便等特点，广泛应用于核酸相关的科研和临床领域。
下面将详细介绍这些方法的原理和应用。
吸光光度法是一种常用的核酸定量方法。
其原理是通过测量核酸分子在紫外（UV）或可见光区域吸收的光的强度来确定其浓度。
核酸在UV区域（260 nm）有较高的吸收峰，可以根据表观摩尔吸光系数来计算核酸的浓度。
吸光光度法简单快捷，操作简便，但只能提供核酸总含量信息，无法区分DNA和RNA，并且对于样品中的杂质、蛋白质和其他分子也会产生吸光，进而影响测定结果。
因此，在使用吸光光度法进行核酸定量时，需要对样品进行纯化和质控处理。
DNA染色剂法是另一种常用的核酸定量方法。
该方法利用DNA染色剂如伯胺黑（Ethidium Bromide，EtBr）或 PI（Propidium Iodide）与DNA结合，形成可视化的荧光复合物。
这些染色剂在无核酸或DNA浓度极低时不发光，只有与DNA结合后形成复合物才发光。
通过测量荧光强度，可以确定DNA的浓度。
DNA染色剂法具有较高的选择性和灵敏度，可以用于测定DNA的含量、纯度和相对分子量，但无法区分DNA和RNA。
此外，染色剂法测定DNA浓度时，需要对样品进行染色，并在测量前对染色剂进行去除以避免干扰。
荧光法是一种基于荧光现象的核酸定量方法，常用荧光标记试剂有SYBR Green I和PicoGreen等。
这些试剂可与DNA特异性结合并发出特定波长的荧光。
荧光强度与DNA浓度呈线性关系，通过测量荧光强度可以精确测定DNA浓度。
相比于吸光光度法和DNA染色剂法，荧光法具有更高的灵敏度和特异性，可以实现DNA和RNA的定量分析。
荧光法还可用于检测特定序列的DNA，如PCR扩增产物以及基因表达分析中的定量RT-PCR 实验等。
综上所述，核酸的定量分析方法种类繁多，吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR是其中常用的方法。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸的定量测定-定磷法
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化 钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
还原剂（抗坏血酸等）
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 2O↓(黄色)+6H2O 6H ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
4.生物化学实验,陈钧辉等编,3版或4版 科学出版社2003
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
核酸定量的方法和原理应用
核酸定量的方法和原理应用一、方法简介核酸定量是实验室中常用的一项技术，用于确定核酸样品中的DNA或RNA的浓度。
准确的核酸定量是许多分子生物学实验的基础，包括聚合酶链式反应(PCR)、脱氧核糖核酸测序和基因表达分析等。
本文将对常见的核酸定量方法和其原理应用进行介绍。
二、常见的核酸定量方法1. 吸光度法(Absorbance method)吸光度法是最常用的核酸定量方法之一。
该方法是基于核酸在紫外光区域的吸收特性来测定其浓度。
核酸样品溶液吸收紫外光的程度与其浓度成正比，可以通过测定吸光度来确定核酸的浓度。
通常使用比色杯、分光光度计或多功能酶标仪等设备进行测量。
2. 荧光染料法(Fluorometric method)荧光染料法是一种常用的核酸定量方法，适用于测定低浓度的核酸样品。
该方法通过加入荧光染料与核酸结合，形成荧光复合物并测量其荧光强度来定量核酸。
常用的荧光染料有SYBR Green、Ethidium Bromide等，可以使用荧光光度计来进行测量。
3. 核酸电泳法(Electrophoresis method)核酸电泳法是一种直接观察核酸浓度的方法。
通过将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据核酸带的强度和大小来估算核酸的浓度。
该方法适用于检测纯度较高的核酸样品，并可同时检测DNA和RNA。
可以使用核酸电泳仪进行实验操作。
三、核酸定量原理应用1. 核酸质量浓度的计算核酸定量方法可以进一步应用于核酸质量的计算。
根据核酸浓度，通过知道样品的体积大小可以计算出样品中的核酸质量。
这对于实验中需要精确配制核酸样品的工作非常重要，同时也有助于确定实验所用核酸的最佳浓度。
2. 酶切反应的优化核酸定量方法可用于酶切反应的优化。
酶切反应是分子生物学研究中常用的方法之一，通过将核酸样品与特定酶酶解，可以切割特定的DNA或RNA序列。
根据核酸定量结果，可以确定切割反应中所需的核酸样品的最佳浓度，从而优化酶切反应的结果。
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
核酸定量检测方法
核酸定量检测方法
核酸定量检测是一种常见的生物学实验技术，用于测定DNA或RNA的浓度和纯度。
这种方法可以用于许多应用，例如基因克隆、PCR反应、RNAi实验等。
核酸定量检测的方法包括分光光度法、荧光定量法、凝胶电泳法等。
其中，分光光度法是最常用的方法。
该方法通过测量核酸在紫外光下的吸收值来确定其浓度。
荧光定量法是一种更灵敏的方法，它使用荧光染料来测量核酸的浓度。
凝胶电泳法是一种用于分离和可视化核酸的方法，通过与已知浓度的DNA或RNA进行比较，可以确定未知样品的浓度。
无论使用哪种方法，都需要注意样品的纯度。
检测前应使用比色法或荧光探针等方法检测样品中是否存在杂质，如果存在杂质，可能会影响检测结果。
此外，还应注意样品的保存和处理条件，以避免样品受到污染或损坏。
总之，核酸定量检测是生物学实验中非常重要的一步，正确的方法和技巧可以确保实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸的定量分析方法
主要有紫外-可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法等。
基于光谱学的定量分析方法的优缺点
优点
操作简单，适用范围广，无需使用放射性同位素标记，可用于多种类型核酸的定量。
缺点
易受样品中杂质的影响，准确性较低，重现性较差。
光谱学定量分析的实例和应用领域
实例
紫外-可见光谱法定量分析DNA和RNA样品中的浓度和纯度。
VS
应用领域
基因组学、蛋白质组学、生物医药、环境 科学、法医学和化学计量学等领域。
05
基于生物芯片的定量分析方 法
生物芯片的原理及定量分析方法
生物芯片原理
生物芯片是一种高通量的生物分析技术，通过将生物分子固定在固相基质上 形成微阵列，然后利用特异性探针进行检测和定量分析。
定量分析方法
通常采用荧光标记或化学发光标记的核酸探针与生物芯片上的核酸序列进行 杂交，然后通过荧光信号或化学发光信号的强度来检测和定量分析目标核酸 序列的浓度。
VS
同位素标记法
通过在标准品和未知品中加入不同量的同 位素标记物，利用凝胶电泳将核酸分子分 离，再通过同位素检测器检测标准品和未 知品中同位素标记物的含量，从而计算未 知核酸浓度。该方法操作简便，但同位素 标记物具有放射性，对环境和人体健康可 能产生影响。
凝胶电泳定量分析的优缺点
优点
凝胶电泳具有高分辨率、可重复性好、操作简便、成本低廉 等优点，是核酸分子定量分析的常用方法之一。
缺点
需要使用较多的试剂和操作步骤，可能会受到非特异性杂交和酶抑制物的影响， 同时也存在一定的误差率。
循环酶放大技术定量分析的实例和应用领域
实例
采用循环酶放大技术对细菌、病毒、基因组、mRNA等多种 类型的核酸进行了定量分析，取得了较好的结果。
核酸含量的测定
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
2
定磷法的原理
首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定 磷试剂测定无机磷量。反应式为：
(NH4)MoO4+H2SO4 H3PO4+12H2MoO4 Vit • C H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 • MoO3（钼蓝） H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 2000( g / mL ) 100%
11
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
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光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
法
0.020 L
A260：260nm处吸光度值读数 0.024：每毫升溶液内含一微克RNA的吸光度 0.020：每毫升溶液内含一微克DNA钠盐时的吸光度
据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。
钼酸盐 （定磷试剂）
含磷有机 物
硫酸或过氯酸消化
无机磷 （酸性条件）
定 磷
磷钼酸盐络合 物
还原剂： 黄色物质 变为蓝黑 色
法
吸收值与 磷含量成
660nm处 有最大光
分光光度计
钼蓝
正比
吸收峰
生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有
机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化
瑞
基团
利
（1）利用生色团在生物大分子上的聚集作用导致共振光散射强度的增
散
强，对蛋白质、核酸等生物大分子进行定量测定。
射
法
（2）利用某些离子缔合物会产生强烈的共振光散射强度，对痕量金属、
非金属以及某些有机物进行定量测定。
1.有机染料作为共振光散射探针
定磷法
测
有机染料
核酸
静电引力
核酸中含磷量与核酸含量成正比,DNA为9.2%,RNA为8.5-9.0%。
紫外分光光度计 上测定 260nm处吸光度
B：钼酸铵-过 氯酸沉淀剂
紫
RNA（或DNA）的质量浓度（ mg/L)
A 260nm
稀释倍数
0.024(0.02 0) L
外
吸 收
A260nm ——A管稀释液在260nm波长处的吸光度减去B
管稀释液在260nm波长处的吸光度
法
核酸的质量分数＝ 待测待液测中液测中得制的品核的酸质质量（量（g）g）100 %
氯化钠介质中小牛胸腺脱氧核糖核酸对铈的
荧光碎灭机理
荧
光
分
Ce(III)具有其独特的荧光性质，在弱酸性的NaCI介质中Ce(III)
析
的荧光被小牛胸腺脱氧核糖核酸(ctDNA)所碎灭，其碎灭机理是
法
Ce(III)的各种阳离子型体与ctDNA上的磷酸根阴离子之间的静电
作用。
荧 光
Ce(III)受254.0nm紫外光激 发在350.0nm处产生荧光
0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P) 260nm（pH7.0）为6600，含
磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1ug DNA钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当待测的核酸样品中不含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核 苷酸，既可将样品配制成一定浓度的核酸溶液（20-50ug/ml）, 在紫外分光光度计上直接测定。
ssDNA电极杂交 （含一定浓度目 的基因杂交液 SSC）
电
化
DNA传感器 （ssDNA通
学
过生物素-亲 和素的方法
法
固载在Pt电 极）
指示剂： Co(phen)33+
工作电极
DNA序列 检测系统
示差脉冲伏 安法(DPV)
电 流 变 化
方波 伏安法(AWV)
线性范围： 8.0×10-9～ 2.8× 10-8
分 析 法
DNA
pH= 8.5的BrittonRobinson缓冲液
浓度与荧光强 度成线性关系
线性范围 1.0～ 10.0mg/ L
检测限 0.46mg/ L
荧 • 荧光分析法灵敏度高、选择性好、操作方便，在生物分析中有非常广
光
泛的应用。
分
析
法 • 由于核酸内源荧光很弱，无法将荧光技术直接应用于核酸结构和性
分
性质。测定中离子强度过高会影响DNA的构象，使DNA表面的阴
析
离子被屏蔽，降低核酸分子竞争阳离子的能力。酸度过低会使核
法
酸中磷酸根质子化，而过高可能会出现金属的难溶物。另外有时
蛋白质的存在会严重干扰测定，须预先去除再进行测定。
槲皮素-钴(Ⅱ)-核酸三元配合物荧光法测定核酸
荧
槲皮素
（微弱荧光）
光
分
紫
紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达
外
3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高
吸
峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，
收
因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
法
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋 白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染物），则测定误差较大，应设法 除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
核酸的定量分析
1
定磷法
2
紫外吸收法
3
荧光光度法
4
共振光散射法
5
电化学法
核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA
定
及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为
磷
9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11
法
倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依
荧 光
由于 DNA 本身荧光很弱，因此不能利用荧光光度法直接测定 DNA 含量，当某些小分子探针与 DNA 结合后，荧光强度会大大
分 增强，而有一些小分子与 DNA结合后，会引起溶液的荧光猝灭
析 作用。基于这些现象，可用荧光光度法测定 DNA的含量。
法
1.荧光染料（荧光探针）
荧
主要是基于嵌入核酸碱基对中，发生共振能量转移导致荧光强度
研
碱性三苯甲烷染料(BTPMD)包括乙基紫(Ethyl Violet， EV)、结晶 紫(Crystal Violet，CV)、甲基紫(MethylViolet，MV)、孔雀石绿
究 (Malachite Green，MG)、亮绿(BrillantGreen，BG)、甲基绿(Methyl
进 展
Green，MeG)和碘绿(Iodine Green，IG)，它们具有相似的结构，在 水溶液中以 离子形式存在。
质的研究中，而必须引入荧光探针。荧光衍生法为研究核酸提供了灵
敏探针，但方法繁琐、操作费时。
电
电化学方法在DNA和RNA的分析中起着重要。
化
研究人员发现DNA的加入使pharmorubicin（表阿霉素）的
学
阳极峰电流明显减小，降低程度与DNA浓度呈良好线性关系。
法
据此建立了测定DNA的电化学分析方法。具有灵敏、快速、
并具有分子识别功能，代表当今生物检测技术的前沿。该方法
测量灵敏度高，能很好地识别转基因食品中的特异DNA序列。
指一束光通过介质时，在入射光方向以 外的各方向观察到的一种光辐射现象。
共
振 瑞
光散射粒子的尺度远小于入射光波长时， 称为瑞利散射（RS）。
利
当瑞利散射位于或接近于散射分子
散
吸收带时，由于电子吸收电磁波频率与散射频率相
定
只要从核酸样品中测得磷的含量即可推算出核酸含量。定磷法
机 理
准确度好,灵敏线度性高,常作为其它方法的基准。但是核酸样品中原 有机无磷机。磷杂质关对系测定有影响号,测瑞增利定强散时射要信注意扣除核酸（复体样合积品物增中离大子的） 无
三芳甲烷类染料
（1）核酸某些碱性三苯甲烷染料体系的RRS及其分析应用
Ce(III)的 各种阳离
子型体
静电作用
荧光猝灭
猝灭程度与ＤＮＡ 浓度呈线性关系
分
析
法
0~6.0×10-6 g/ml 3.0×10-6~8.0×10-
小牛胸腺
6g/ml
(ct)DNA
上的磷酸
根
荧 光 分 析 法
激发
发射
光谱特征
3.金属络合物（荧光探针）
荧
光
多是过渡金属元素络合物，主要是基于络合物立体结构的发光
荧 光 分 析 法