细胞凋亡的形态学检测1

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细胞凋亡与检测原理

细胞凋亡与检测原理

细胞凋亡与检测原理细胞凋亡(apoptosis)是一种由体内分子机制调控的程序性死亡过程。

细胞凋亡对于维持身体健康和发展正常的组织功能至关重要。

它在多种生理和病理过程中发挥重要作用,包括胚胎发育、免疫监视和应答、细胞数量调节、损伤修复和肿瘤的发展等。

因此,对细胞凋亡的检测与研究对于了解细胞凋亡的机制和应用于治疗疾病具有重要意义。

细胞凋亡的检测可以通过多种方法和实验手段进行,下面将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法及其原理。

1.形态学检测法:细胞凋亡在形态上表现为细胞体积的缩小、细胞核染色质的凝结、细胞核的畸变和断裂等特征。

这些特征可以通过光学显微镜观察到。

常用的形态学检测方法有苏木精-伊红染色、核小体染色和电镜观察等。

2.核酸染色检测法:细胞凋亡过程中,细胞核内的DNA分子发生明显的断裂和畸变,这可以通过核酸染色荧光探针来检测。

常用的核酸染色方法有荧光染料染色、DNA单断链检测和TUNEL(转移酶介导的末端标记化反应)法等。

TUNEL法是最常用的细胞凋亡检测方法之一,它通过用荧光标记亲和剂连接到DNA断裂末端的3'-OH基团来检测细胞凋亡的程度。

3. 蛋白质检测法:细胞凋亡过程中,许多蛋白质的表达水平会发生明显变化。

比如,细胞凋亡会导致Bax、Caspase家族蛋白的活化和表达增加,而抑制凋亡的蛋白质Bcl-2则会下调。

因此,通过Western blot 和免疫组化等方法,可以检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平的变化。

4.流式细胞术:流式细胞术是一种通过光电探测器测定细胞数量和特征的方法。

流式细胞术可以通过筛选和排序上述染色体和蛋白质等特征,来确定细胞凋亡发生的程度和类型。

比如,通过测定细胞的细胞质内的卵磷脂翻转(PS)外露与细胞核DNA染色剂(如PI)结合的比例,可以鉴定凋亡细胞和坏死细胞。

细胞凋亡的检测原理是基于细胞凋亡的特征改变。

比如,形态学检测法通过观察细胞的形态学变化来鉴定细胞凋亡;核酸染色检测方法通过检测DNA断裂和畸变来判断细胞凋亡;蛋白质检测法则通过检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平变化来鉴定细胞凋亡。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。

因此,准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。

本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法,希望能为相关研究提供一些参考。

首先,细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。

因此,通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。

在实验中,可以使用荧光染料(如荧光素酶、荧光素酶底物等)标记细胞核和细胞膜,然后观察细胞形态的改变。

这种方法简单直观,但不够精确,需要结合其他方法进行验证。

其次,细胞凋亡过程中,细胞内的DNA发生断裂和片段化,产生特征性的DNA ladder。

因此,DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以通过DNA提取、电泳等技术,检测细胞内DNA的片段化情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确,但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。

另外,细胞凋亡过程中,细胞膜上的磷脂会外翻,暴露磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞表面。

因此,PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS,然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏,但需要较为昂贵的试剂和设备。

最后,细胞凋亡过程中,细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变,如半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化。

因此,caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以使用荧光染料标记caspase活性底物,然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。

这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性,但需要较为复杂的实验操作和数据分析。

综上所述,细胞凋亡的检测方法多种多样,各有优缺点。

在实际研究中,可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。

希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助,推动细胞凋亡机制的深入研究,为疾病的防治提供新的思路和方法。

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法Company number:【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法(1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。

(2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

(3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。

如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。

(4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。

检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物,测光吸收制。

用途该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。

简述细胞凋亡的检测方法

简述细胞凋亡的检测方法

简述细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡检测方法简述如下:
①形态学检测:利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化,如细胞收缩、核染色质浓缩等。

②Annexin V标记:利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性,荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸,结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。

③TUNEL染色法:检测细胞DNA断裂情况,通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口,荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。

④Hoechst染色:使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核,观察凋亡细胞核形态的改变,如浓缩、碎裂。

⑤DNA Ladder电泳:提取细胞DNA进行凝胶电泳,凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带,反映DNA在核小体间的特定位置断裂。

细胞凋亡检测

细胞凋亡检测

第一节细胞凋亡的基础一、细胞凋亡的概念(一)细胞凋亡概念的提出细胞凋亡(apoptosis)或称程序化细胞死亡,是多细胞有机体为调控机体发育,维持内环境稳定,由基因调控的细胞主动死亡过程。

对凋亡概念的认识和研究可划分为形态、生化和基因3个阶段。

本世纪六十年代,Kerr在形态学上描述了在结扎肝静脉后增生的肝实质发生退行性变时一种明显的细胞死亡方式,这种死亡细胞变圆固缩,散在分布。

由于当时细胞死亡与坏死是同义词,Kerr将这种细胞死亡方式命名为固缩坏死(shrinkage necrosis)。

然而,固缩坏死常发生在有生物学意义的背景中,并在形态学上与坏死明显不同。

因此,1972年,Kerr等提出了细胞凋亡的概念。

经过后来诸多学者的研究,对细胞凋亡的意义有更深入的认识,认为细胞凋亡是生物体普遍存在的现象,广泛发生于胚胎形成、器官发育、组织更新、受损和衰老细胞的清除、维持组织器官中细胞数目的恒定等生理和病理过程。

(二)细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必须的,具有重要的生理学意义,主要表现在:①细胞凋亡在生物界普遍存在;②细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的内容,贯穿于全部寿命周期中;③细胞凋亡是生物在进化过程中形成的死亡方式。

细胞凋亡的生物学作用主要有:①清除无用的细胞;②清除发育不正常的细胞;③清除已完成任务的细胞;④清除有害的细胞。

二、细胞凋亡的特征(一) 形态学特征1. 细胞核的变化(1) 染色质凝聚:核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段,并向核膜下或中央部异染色质区聚集,形成浓缩的染色质块。

凋亡细胞中染色质块聚集于核膜下,称边集;或聚集于核中央部,称中集。

染色质聚集部以外的低电子密度区为透明区,是由于核孔变大从而导致其通透性增大,细胞质中水分不断渗入而造成。

(2) 核碎片:核碎片发生的过程有以下几个步骤,首先是透明区不断扩大,然后是染色质进一步凝聚,核膜在核孔处断裂;随后核膜包裹分割染色质,形成核碎片2. 细胞质的变化(1) 胞质浓缩:细胞脱水,细胞质明显浓缩,凋亡细胞体积为原细胞体积的70%左右。

细胞凋亡检测指标

细胞凋亡检测指标

细胞凋亡检测指标细胞凋亡是一种正常的细胞自我死亡过程,它是维持生命活力的重要机制之一。

在人体的细胞分化和生长发育过程中,细胞凋亡起着举足轻重的作用。

除此之外,在诸如器官发育、免疫系统、精子成熟等生理和病理过程中,都会涉及到细胞凋亡。

因此,了解细胞凋亡是否存在变化,对于疾病诊断和治疗、肿瘤的治疗等方面都有着非常重要的意义。

为了监测细胞凋亡的过程和幅度,在实验室中,常常会检测一些特定的标志物,用于评估细胞凋亡的程度和病理变化。

这些指标中分为分子生物学指标和细胞形态学指标两种。

分子生物学指标是指能够直接或间接地反映细胞凋亡过程的分子或信号通路指标。

这些指标主要有DNA片段化(DNA Fragmentation)和细胞凋亡相关蛋白(Apoptosis-related Proteins)。

DNA片段化是指在细胞凋亡过程中,核染色质长链骨架逐渐裂解,DNase(脱氧核糖核酸酶)作用于DNA分子,将DNA大分子逐段切裂成中小分子片段。

DNA片段可通过凝胶电泳等方法检测,以判断细胞凋亡程度。

DNA碎片的侧翼泳动情况可以区别经典型凋亡(西方人样)与非经典型凋亡,在肿瘤细胞的检测中常常会用到。

细胞凋亡相应的蛋白(Apoptosis-related Proteins)是指在细胞凋亡过程中发生改变的一系列蛋白质,例如组蛋白、Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白等。

其中,Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白被认为是细胞凋亡过程中最具代表性的标志物之一。

Bcl-2家族蛋白可以分为正调控Bcl-2(抑制凋亡)和负调控Bax(促进凋亡)两类,它们在肿瘤细胞的凋亡处理中起了重要的作用。

Caspase家族蛋白质是细胞凋亡信号通路的关键蛋白质,其中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3是TEE最常见的Caspase,也是促进凋亡的重要因素。

与分子生物学指标相对照,细胞形态学指标是通过显微镜和细胞成像技术进行观察、分析和判断的。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。

因此,对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。

在本文中,我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法,以及它们的优缺点和适用范围。

1. 形态学观察法。

形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。

通过光学显微镜观察细胞形态的变化,如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等,来判断细胞是否发生凋亡。

这种方法简单直观,但不适用于高通量检测和定量分析。

2. DNA断裂检测法。

DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征,因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。

常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。

这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析,但需要特殊仪器和试剂,操作较为复杂。

3. 蛋白质检测法。

细胞凋亡过程中,一些特定的蛋白质会发生变化,如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。

因此,可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。

常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。

这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势,但需要特异性抗体和专门仪器。

4. 细胞色素C释放检测法。

在细胞凋亡过程中,线粒体膜通透性增加,导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。

因此,可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。

常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。

这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。

综上所述,不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点,研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。

随着生物技术的发展,新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现,相信在不久的将来,会有更多更简便、灵敏的方法问世,为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。

细胞凋亡的检测原理

细胞凋亡的检测原理

细胞凋亡的检测原理
细胞凋亡的检测原理主要包括:
1. 形态学观察:细胞凋亡时,通常会出现一系列形态学的变化,如细胞核染色质凝聚、胞质收缩、细胞核碎裂等。

通过显微镜观察细胞形态的变化,可以初步判断细胞是否经历了凋亡过程。

2. 细胞凋亡标记物检测:细胞凋亡过程中,常常会出现一些特定的生物标记物的改变,如细胞膜外翻的磷脂,如磷脂血小板活化因子(phosphatidylserine,PS);细胞核内特异性酶活性
的改变,如DNA酶(DNAse)的活化;细胞质内特定蛋白的
表达和位置改变等。

利用这些特定标记物的改变,可以通过免疫荧光染色、荧光探针标记等方法来检测凋亡细胞的存在和数量。

3. DNA断裂检测:细胞凋亡时,DNA会发生断裂并形成大小
不等的DNA片段。

传统的DNA断裂检测方法包括DNA凝胶
电泳和TUNEL反应。

其中,DNA凝胶电泳是通过电泳将
DNA片段按照大小分离,从而检测细胞凋亡的存在和程度;TUNEL反应则是利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记
的核苷酸与DNA断裂端连接,通过荧光或酶标反应来检测凋
亡细胞。

4. 细胞凋亡相关蛋白的检测:细胞凋亡过程中,会有一系列蛋白质的变化。

常用的检测方法包括Western blot和流式细胞术。

通过检测细胞凋亡相关蛋白如caspase家族蛋白(caspase-3、caspase-8等)的表达或活性变化,可以间接判断细胞是否发
生凋亡。

综上所述,通过观察细胞的形态变化、检测细胞凋亡标记物的
改变、DNA断裂以及细胞凋亡相关蛋白的表达和活性变化等多种方法,可以对细胞凋亡进行检测和判断。

细胞凋亡的形态实验报告

细胞凋亡的形态实验报告

一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征,了解细胞凋亡的发生过程,为细胞凋亡的研究提供形态学依据。

二、实验材料1. 细胞培养:小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3细胞);2. 试剂:H2O2(双氧水)、Annexin V-FITC、PI(碘化丙啶)、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液;3. 仪器:倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。

三、实验方法1. 细胞培养:将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养,待细胞生长至80%左右时,进行实验处理。

2. 实验分组:(1)正常组:不做任何处理,作为对照组;(2)凋亡组:加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。

3. 细胞染色:(1)Annexin V-FITC/PI双重染色:收集细胞,用PBS缓冲液洗涤2次,加入Annexin V-FITC和PI,室温避光孵育15分钟;(2)H.E染色:收集细胞,用PBS缓冲液洗涤2次,加入H.E染色液,室温避光孵育15分钟。

4. 细胞观察:(1)荧光显微镜观察:用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征,包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等;(2)流式细胞仪检测:用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5. 数据分析:采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

四、实验结果1. 荧光显微镜观察:凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征,与对照组相比,凋亡组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。

2. 流式细胞仪检测:凋亡组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),约为对照组的2倍。

五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,具有形态学特征,如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。

本实验中,凋亡组细胞出现这些形态特征,表明细胞凋亡已发生。

2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法,可以检测细胞凋亡率。

细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心

细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心

摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1 光学显微镜和倒置显微镜(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。

三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DN A的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。

储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。

3 透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

细胞凋亡的检测方法及原理

细胞凋亡的检测方法及原理

七年级春季道德与法治期中考试试卷分析及总结一、引言七年级春季道德与法治期中考试是对学生道德法治知识掌握情况的一次全面检验。

本次考试旨在通过试卷的命题和评测,了解学生在道德观念、法治意识、社会认知等方面的学习情况,为今后的教学提供有针对性的指导。

二、试卷结构分析本次道德与法治期中考试试卷结构清晰,题型多样,包括选择题、填空题、简答题和分析题等。

试卷内容涵盖了七年级上册道德与法治教材的主要知识点,注重对学生基础知识和综合运用能力的考查。

三、考试情况总结1.学生整体表现从整体上看,大部分学生在本次考试中表现良好,能够较为准确地掌握道德法治的基本知识。

在选择题和填空题部分,学生对基础知识的掌握较为扎实;在简答题和分析题部分,学生能够结合所学知识对问题进行较为深入的分析和回答。

1.存在问题及原因分析然而,在考试中也暴露出一些问题。

部分学生对道德法治知识的理解和应用不够深入,难以将所学知识与实际生活相结合;在简答题和分析题部分,部分学生缺乏清晰的思路和准确的表达,导致答案不完整或偏离题意。

这些问题产生的原因主要有以下几点:一是部分学生对道德与法治学科的学习兴趣不高,缺乏学习动力;二是教师在教学过程中未能充分激发学生的学习兴趣,教学方法单一;三是学生缺乏足够的实践机会,难以将理论知识与实际生活相结合;四是学生在平时的学习中缺乏对基础知识的巩固和拓展。

四、改进措施及建议针对以上问题,提出以下改进措施及建议:1.加强基础知识的巩固和拓展,提高学生的道德法治素养。

2.注重实践教学,通过案例分析、角色扮演等方式,将理论知识与实际生活相结合,提高学生的应用能力。

3.采用多种教学方法和手段,激发学生的学习兴趣和积极性,如开展课堂讨论、组织社会实践活动等。

4.加强师生之间的交流和互动,及时了解学生的学习困难和问题,提供有针对性的指导和帮助。

五、结语本次七年级春季道德与法治期中考试试卷分析及总结旨在发现学生学习中的问题和不足,为今后的教学提供有益的参考和借鉴。

七种常见细胞凋亡检测的方法与注意事项-推荐下载

七种常见细胞凋亡检测的方法与注意事项-推荐下载

大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式,大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来,细胞凋亡检测的方法不少,这里就总结下7种常用的检测方法大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式,大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来,细胞凋亡检测的方法不少,这里就总结下7种常用的检测方法。

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1 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

(2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。

三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T 碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。

储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。

细胞凋亡检测方法总结

细胞凋亡检测方法总结

1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为早期凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

右上象限为独立的核(FITC-/PI+)。

Annexin-V可以再钙离子存在的情况下,和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合,而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

PI是一种DNA染料,当细胞凋亡的晚期,细胞的细胞膜通透性增加,PI从而进入细胞核与DNA结合。

所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞,如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长,或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源:易生物实验浏览次数:197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词:细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在凋亡的细胞,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC(膜联蛋白-V-FITC)500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液(Binding Buffe)r 40/20 mlPBS(1×)60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片(用于荧光显微镜观察)盖玻片(用于荧光显微镜观察)去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1.凋亡细胞的制备:小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重,10h后解剖取胸腺,分离胸腺细胞。

(整理)细胞凋亡的检测含图片陈英玉

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细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1 光学显微镜和倒置显微镜(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。

三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。

储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。

3 透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡的检测方法

三、线粒体膜势能的检测
• 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用, 多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细 胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位DYmt的下 降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最 早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征 (染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦 线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。
四、DNA片断化检测
• • • • 1. 大分子染色体DNA片段的测定 2. DNA Ladder 测定 3. 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析 4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
五 TUNEL法
• 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断 裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下, 将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、 碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶 介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
二、磷脂酰丝氨酸外翻分析 (Annexin V法)
• 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位 于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在 细胞外环境中。 • Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖 性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。 将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin 标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利 用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的 发生。

细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察

细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察

细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察细胞凋亡(apoptosis)的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。

目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化,检测凋亡细胞的方法也逐渐增多,但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。

一、光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,有时可碎裂。

在HE染色的组织切片中细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。

在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。

本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。

本方法可用于调亡现象的初步观察,作为分析指标之一。

检测方法:细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色,在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变,结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

二、视频时差显微技术(video time-lapse microscopy)本方法用于细胞培养,通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程,尤其是观察细胞表和外形的变化。

凋胞与基质分离,胞体变圆、收缩、出泡,有的细胞拉长,出现钉状突起,特续数小时后细胞膜破裂,细胞溶解,通过连续观察,本方法可养壑培养中的凋亡细胞,但不能用于病理组织。

检测方法:收集2×105细胞/ml培胞,置于多孔培养板,加入凋亡诱导剂,在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变,每隔分钟 30秒作序列摄影,连续24小时。

如同进进行荧光染色,可参荧光晃微镜下观察和摄影。

三、电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征,包括透射电镜和扫描电镜下的改变,在许我文献中已有详尽描述。

凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩,染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜,核的碎裂和凋亡小体形成等,在透射电镜下得到最佳的体现。

为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。

本方法的缺点是样品制作过程较复杂,且仪器、设备的费用昂贵,较难广泛大量开展。

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荧光显微镜下检测细胞凋亡
作者:2010级生物技术许春燕
摘要:
细胞凋亡是生命科学目前的一个研究热点.检测细胞凋亡的方法和技术取得了很大的进步.从早期细胞内某些基因转录表达的变化、代谢生理的变化,到晚期细胞形态的确诊、细胞内代谢物质的转变,从定性、定量到原位定性定量等,都发展了相对成熟的检测技术.相比于其他检测方法,荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。

关键词:细胞凋亡荧光显微镜观察法
正文:
下面是荧光显微镜下检测细胞凋亡的四种方法:
1、吖啶橙染色法
用吖啶橙溴化乙锭混合染色法。

吖啶橙对DNA有特异的亲和力。

结果判定。

荧光显微镜下,可见到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光,胞质呈橘黄色或者橘红色荧光,出现凋亡细胞时,核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧,凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认。

坏死细胞的细胞质内黄绿色或者橘黄色荧光减弱,有的甚至消失。

具体方法如下:
(1).制备活细胞悬液,浓度约为107/ml。

(2).取95μl的细胞悬液,加5μl的吖啶橙贮存液混匀。

(3).吸一滴混合液点洁净玻片上,直接用盖玻片封片。

(4).荧光显微镜选用激发滤片BG 12或BV等,阻断滤片用515nm 或。

对体外培养的活细胞经荧光素处理后,可在荧光显微镜下直接观察细胞形态的改变.
结果;用吖啶橙染色后正常细胞核DNA呈黄色或黄绿色的均匀荧光,细胞质和核仁的RNA呈桔黄或桔红色荧光;凋亡细胞的细胞核或细胞质内有致密浓染的黄绿色荧光,甚至有黄绿色碎片;坏死细胞的细胞质内的荧光较弱或无。

2、Hoechst33258染色法
Hoechst33258能够穿过完整的细胞膜,所以可以用来染活细胞,在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。

在荧光显微镜紫外光激发时,Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。

具体方法如下:
(1).原代细胞培养,细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

(2).细胞固定液4℃固定5min。

(3).蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min。

(4).蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体。

(5).封片剂封片后荧光显微镜观察。

结果:用Hoechst 33258染色后活细胞核呈弥散均匀的荧光,凋亡细胞内可见浓染致密的颗粒状荧光或块状荧光.该方法方便易行,应用较多,但定量和定性方面较差。

故在实际应用中极少被单独使用。

3、Hoechst33342染色法
Hoechst33342能够穿过完整的细胞膜,所以可以用来染活细胞,在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。


荧光显微镜紫外光激发时,Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。

具体方
法如下:
(1).将Hoechst33342加入培养的细胞中,终浓度为10μg/ml 37℃
孵育30min。

(2).4%的多聚甲醛和培养液以1:3混合,使多聚甲醛的浓度为
1%,固定细胞5~10min。

(3).固定好后,将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

(4).荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片,阻断滤片为400~
500nm。

以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法,也可先固定后染色:
具体方法如下:
(1).收集(0.5~3.0)&time106个细胞,500~1000r/min,离心5min 去上清。

(2).洗1次,500~1000r/min,离心5min去。

(3).用3%多聚甲醛50μl重悬细胞,室温下固定10min。

(4).洗1次,500~1000r/min离心5min去。

(5).用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞,终浓度为16μg/ml,孵育15min。

(6).取10μl放在玻片上,荧光显微镜下观察,可数500个细胞,计算调亡率。

4.DAPI法
DAPI与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。

结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

展望:
尽管目前已经有不少方法可以检测细胞的凋亡,象透射电镜、荧光显微镜及流式细胞仪等可大致检测出细胞凋亡的早、中、晚期,而且能区分凋亡细胞和坏死细胞;PI染色后用流式细胞仪检测可对大量标本进行检测,Hoechest结合PI染色区分凋亡细胞和坏死细胞,AnnexinV联合PI检测膜完整性等都是较为理想的方法;尤其是TUNEL法既确定细胞凋亡,又显示细胞表面抗原,定性定量的检测更具优势。

结论:荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。

荧光染色法检测的细胞凋亡率大于流式细胞仪方法的检测值是因为荧光染色法能把不同时期的细胞凋亡都显示出,特别是早期凋亡细胞。

不足之处是:显微镜下人工识读玻片仍是一个主观方法.在凋亡
的判断标准上每个实验室及个人都会有不同,导致一些结果出现较大变异。

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