Ca2+对杜仲愈伤组织诱导及增殖效应的影响研究

Ca2+对杜仲愈伤组织诱导及增殖效应的影响研究

摘要：以杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）幼茎为外植体，进行杜仲愈伤组织诱导、增殖实验。在培养基中添加不同浓度的Ｃａ２＋进行筛选实验，以确定诱导、增殖培养基中的最佳Ｃａ２＋浓度。结果表明适度增加Ｃａ２＋浓度，可促进杜仲愈伤组织的诱导和增殖，并能改善愈伤组织的生长状态，增加愈伤组织增殖生长量。但若Ｃａ２＋浓度超过１２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，促进效果减弱。

关键词：杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）；Ｃａ２＋；愈伤组织；增殖

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ；Ｃａ２＋；ｃａｌｌｕｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）是杜仲科（Ｅｕｃｏｍｍｉａｃｅａｅ）杜仲属（Ｅｕｃｏｍｍｉａ）多年生落叶乔木，是我国特有的经济树种、国家二类重点保护植物，也是名贵的中药材和提胶工业原料。杜仲的干燥树皮含有丰富的生物活性成分，具有补肾、健腰、强筋、壮骨、安胎等功效，可以提高机体缺氧耐力、改善机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压，且久服轻身耐老、延年益寿［１］。但杜仲树生长缓慢、栽培周期长，剥皮对树的生长有影响，限制了杜仲药材的产量。曾黎琼等［２］研究表明，杜仲愈伤组织中含有与叶和皮相同的药用成分。因此，利用植物组织培养技术获得次生代谢产物有望成为大规模生产杜仲有效药用成分的主要手段［3］。本实验通过改变培养基中Ｃａ２＋浓度，筛选适于杜仲愈伤组织诱导和增殖的Ｃａ２＋浓度，以期进一步提高杜仲愈伤组织诱导、增殖率，为大规模生产杜仲次生代谢产物提供参考。

１材料与方法

１．１材料

以渭南师范学院校园栽培一年生杜仲嫩枝条为实验材料。

１．２方法

１．２．１杜仲愈伤组织的诱导剪取一年生杜仲嫩枝条，放入烧杯中加入适量洗衣粉，在自来水下冲洗２ｈ左右，再用蒸馏水冲洗５ｍｉｎ，于超净工作台内，先用７５％酒精处理３０ｓ，再用０．１％氯化汞处理１２ｍｉｎ，然后用无菌水冲洗５～６次，将幼嫩茎段切成１．０～１．５ｃｍ长作为外植体，每瓶接种３个外植体，诱导培养基为：ＭＳ＋１.0 ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．７％琼脂＋３％蔗糖＋５００ｍｇ／Ｌ脯氨酸＋３００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋１％ＰＶＰ，ｐＨ值６．０，培养基中添加Ｃａ２＋浓度梯度为０、３．０、６．０、９．０、１２．０、１５．０、２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ，每个浓度梯度设置３个重复。在（２２±１）℃、光照强度为１５００～２０００ｌｘ条件下每天光照１３ｈ，诱导愈伤组织形成，３周后统计诱导率，并观察愈伤组织生长状态。

１．２．２杜仲愈伤组织的增殖茎段在培养基上诱导２１ｄ后，将质地相当的淡黄绿色、较疏松、有光泽、生长旺盛的愈伤组织块小心切下，继代于增殖培养基（ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．７％琼脂＋３％蔗糖＋５００ｍｇ／Ｌ脯氨酸＋３００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白）上，每瓶接种４块愈伤组织。培养基中添加Ｃａ２＋浓度梯度为０、３．０、６．０、９．０、１２．０、１５．０、２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ，每个浓度梯度设置３个重复。在（２２±１）℃、光照度为１５００～２０００ｌｘ条件下每天光照１３ｈ，２０ｄ后统计愈伤组织生长情况，以愈伤组织相对生长量［（培养后重－培养前重）／培养前重］为指标，确定继代培养基最适Ｃａ２＋浓度。

２结果与分析

２．１诱导培养基Ｃａ２＋浓度的筛选

幼嫩茎段在诱导培养基上培养４ｄ开始膨大，１周左右就能在茎接触培养基的一端看到愈伤组织，培养过程中茎段不断膨大，２周左右茎段基部开始完全愈伤组织化，质地较疏松、颜色淡黄绿、有光泽、生长旺盛（图１）。从图２可见，培养基中添加３．０～１２．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋时，随着Ｃａ２＋浓度的提高，杜仲愈伤组织诱导率呈现升高的趋势，添加１２．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋时诱导率最高，达１００％，较不添加Ｃａ２＋的培养基高３３．３３个百分点。当Ｃａ２＋浓度提高到１５．０～２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，愈伤组织诱导率不再增加而呈现下降趋势，且添加２０．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋的培养基中愈伤组织的诱导率低于不添加Ｃａ２＋的培养基。

２．２Ｃａ２＋对杜仲愈伤组织增殖的影响

适当增加增殖培养基中Ｃａ２＋浓度，对杜仲愈伤组织的生长有促进作用，相对生长量提高，且愈伤组织生长状态也有所改善，变得结构更疏松、富有光泽呈奶油色，生长旺盛，相对生长量大（图３）。其中以添加１２．０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋时，相对生长量最高，达７．７，较对照增长４．３。但当Ｃａ２＋浓度增大到１５．０～２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，杜仲愈伤组织的相对生长量有所下降（图４）。

３讨论

Ｃａ２＋是高等植物体内普遍存在的一种信使分子，参与植物体内多种生理变化及抗逆境的过程［４－６］。现已知在植物体内Ｃａ２＋和钙调素参与了许多与激素有关的生理过程，适当浓度Ｃａ２＋处理对胡萝卜、三叶胶、小麦及水稻等的愈伤组织诱导及增殖有较大的促进作用［７－１０］。吴娟子等［１１］研究发现适度提高Ｃａ２＋浓度，水稻愈伤组织诱导率有增高趋势，但Ｃａ２＋浓度升高到１００ｍｍｏｌ／Ｌ时诱导率却下降。付凤玲等［１２］研究Ｃａ２＋在玉米愈伤组织继代及盐诱导脯氨酸积累中的作用，发现提高培养基中的Ｃａ２＋浓度，对玉米幼胚胚性愈伤组织的继代具有明显促进作用，促使盐胁迫下愈伤组织游离脯氨酸的积累，改善细胞组织生长状态。此外，还有研究发现适当提高Ｃａ２＋浓度可使ＡＢＡ诱导的特异ＲＡＢｍＲＮＡ表达水平提高，对植物体细胞胚的发生与发育具有重要的促进作用［１３］。本实验结果显示，培养基中添加不同浓度的Ｃａ２＋对杜仲愈伤组织的诱导、增殖都有影响。适当提高Ｃａ２＋浓度，杜仲愈伤组织的诱导率、增殖生长量均有增加趋势，以１２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时效果最佳，但当Ｃａ２＋浓度超过１２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时促进作用减弱，与已报道的实验结果一致。对于Ｃａ２＋促进不同植物愈伤组织诱导及增殖率的机理，还有待于进一步深入研究。

参考文献：

［１］李琰，姜在民，唐锐．杜仲叶片愈伤组织诱导的激素优化研究［Ｊ］. 植物研究，２００６，２６（２）：１８２－１８６．

［２］曾黎琼，谢金伦，胡志浩，等．杜仲愈伤组织与树皮、新鲜叶片的化学成分比较［Ｊ］．西南农业学报，１９９４，７（４）：７７－８０．

［３］李琰，董娟娥，姜在民，等．杜仲愈伤组织中次生代谢产物积累动态研究［Ｊ］. 西北植物学报，２００４，２４（１１）：２０３３－２０３７．

［４］何龙飞，沈振国，刘友良．铝胁迫下钙对小麦液泡膜功能和膜脂组成的影响［Ｊ］．南京农业大学学报，２０００，２３（１）：１０－１３．

［５］ＢＵＳＨＤＳ．Ｃａｌｃｉｕｍｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，１９９５，４６（１）：９５－１２２．

［６］利容千，朱英国，孟祥红．水稻红莲－粤泰不育系花粉与药隔组织Ｃａ２＋的分布［Ｊ］．作物学报，２００１，２７（２）：２３０－２３６．

［７］ＯＶＥＲＶＯＯＲＤＥＰＪ，ＧＲＩＭＥＳＨＤ．Ｔｈｅｒ