酶分子修饰

1.1.2 酶的小分子修饰作用
用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提 高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰 酶表面的一些基团：—COOH、一NH3+、— SH、—OH、咪唑基等。 如将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更 强的基团，酶的热稳定性在60℃时提高了1000倍， 温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经 受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶 马肝醇脱氢酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和 甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加 最大，同时酶的稳定性也提高了。
什么是酶分子修饰？
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行 改造，以达到改构和改性的目的. 即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基 团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行 共价连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被 称为修饰试剂。
为什么要进行酶分子修饰？
酶具有稳定性差，活力不够高，以及 可能具有抗原性等弱点使酶的应用受限制。 因此人们希望通过酶分子修饰来改善这些弱 点，来提高酶的使用范围和应用价值。
此外，还有脂质体包裹、反相胶团微囊化等 修饰方法
1.2 酶分子内部的修饰
1.2.1非催化活性基团的修饰
用化学试剂与酶蛋白上的非催化活性基团部位的一 些氨基酸残基进行共价连接进行修饰的方法。
被修饰的残基可以是亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、 His)，也可以是亲电的(Tyr、Trp)．还可以是可氧化的(Tyr、 Trp、Met)。 对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。
Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的稳定性和抑 制作用发生显著改变：Mn-SOD对H2O2稳定性显 著增加．而对NaN3的抑制作用显著降低。
第二节 酶侧链基团的修饰
酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定 性和消除作为外源物质在体内的抗原性。 要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和 反应条件的选择以及对酶学性质的了解等 方面，都必须有足够的了解。
共价修饰
• 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 • 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 • 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以 使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； • 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力 达到原有酶活力的5.1倍
1.3.2 酶的金属离子置换修饰
• 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会
丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子， 酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 • 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出
不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，
有的可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
金属离子置换修饰的过程
金属离子置换修饰的注意事项
金属离子置换修饰只适用于那些在分子 结构中本来含有金属离子的酶。

用于金属离子置换修饰的金属离子，一
般都是二价金属离子。
金属酶的金属取代举例
如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被Co2+取 代后的酶，其最适pH和底物专一性都有改变：Zn 酶对乙酰Ala的最适pH8.5．而Co酶为7.0；钴酶 对N—氯乙酰Ala等6种底物的水解活力增加，而 对N—氯乙酰Met等三种底物的活力降低。在使用 时对不同底物可以选用不同的酶——Zn/Co酶。
2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某一种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。
酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有： 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、 吲哚基、硫醚基及二硫键等。
2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性
（1）对巯基的化学修饰 巯基是蛋白质的一类 重要的亲核基团，因此常被用来修饰。修饰方法 大体上有如下几种：
1.2 酶分子内部的修饰
1.2.3 酶蛋白主链修饰
酶蛋白主链修饰主要是靠酶法对酶蛋白的主链进 行相关修饰。
如用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后， 酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位 分子量变化不大。这说明天然酶平时处于非最佳的催 化构象状态。
1.3.2 酶的金属离子置换修饰
右旋糖酐的活化：
右旋糖酐经高碘酸活化后，酶上氨基共价结合形成 修饰酶。
大分子结合修饰后的酶，呈现出来的催化特性： （1）通过修饰提高酶活力 （2）通过修饰增加酶的稳定性 （3）通过修饰降低或消除抗原性
1.1.5 脂质体包裹
酶脂质体包埋，能使一些被包埋的大分子的酶进入 细胞内。 许多医药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大， 不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免疫原 性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决， 如SOD用聚乙二醇(PEG)修饰，修饰后其在体内的 稳定件及免疫原性都大大改善。但如何让修饰后的 SOD进入细胞内？可以采用脂质体包裹的方法。
2.1被修饰酶的性质 在开展酶的修饰工作前．对被修饰酶的酶学性质必 须有一个较为全面的了解。
2.1.1 酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及PH范 围以及最适温度、最适PH的情况等应有所了解。 2.1.2 酶活性中心的状况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此对酶活 性中心的组成，如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其 侧链基团参与了酶活性中心．是否需要辅因子，此 外还需了解酶分子形状、寡聚酶的亚基组成等。
（2）大分子共价修饰
利用水溶性大分子与酶结合使酶的空间结构发生 某些精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法 称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄 糖、环状糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纤维 素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表 面、形成一层覆盖层。 这些大分子修饰剂在使用前一般需经过活化，然 后在一定条件下与酶分子中的侧链基团以共价键 结合对酶分子进行修饰。
• 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水 溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并 可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产 生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶 天然SOD 右旋糖酐-SOD Ficoll(低分子量)–SOD Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD 半衰期 6 7 14 24 35 min h h h h 相对稳定性 1 70 140 240 350
酶的大分子修饰总结
非共价修饰
• 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护 酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既 能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地 与外部水相连，从而保护酶的活力。
• 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等 能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 • 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作 用力，其稳定性也就增加了。
酶分子的修饰： 酶的表面修饰 酶的内部修饰.
1.1 酶的表面修饰 1.1.1 化学固定化 一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶 共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改 变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改 变．
固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体， 并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向 碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏 移。因此在生产工艺中需几个酶协同作用时，由 于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。 如将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由 4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠 近，这样可简化高果糖浆生产工艺。
酶分子修饰的意义
• 提高酶的活力 activity • 增强酶的稳定性 stability
• 降低或消除酶的抗原性 immunological property • 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的 影响 structure
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第一节
酶分子的修饰方法
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1.2.2 催化活性基团的修饰
通过有目的、选择性修饰侧链成分来实现催化活 性基团部位内的氨基酸的取代，这种将氨基酸侧 链转化为另一种新的氨基酸侧链的方法，叫化学 突变法。
如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys 残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力， 但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方 法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没 有蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基 酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除
去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金属 螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金 属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛 层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时酶 往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：去离子的酶液中加入一定量另一种金属 离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置 换离子，就可得到经过金属离子置换后的酶。
脂质体是天然脂类和或类固醇组成的微球体。 酶分子可包埋在其内部。它可通过与细胞的膜融合 或内吞作用而进入细胞内。 脂质体无毒、易制作，亦被用作基因载体。把 经过表面修饰的SOD包埋在脂质体中便可进入细 胞。Michelsonn发现，被包装的SOD进入细胞的 能力比非脂质体大得多，但包装后的SOD进入胞 内能力与脂质体成分及电荷特性有关。
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使
酶的特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属
离子置换修饰。 酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、 稳定性及其抑制作用。
• α -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子 (Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸 酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、 锌离子(Cu2+,Zn2+)
大分子共价修饰后的这种可溶性酶有许多有用的 性质：如用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)， 不仅降低或消除酶的抗原性，且提高了稳定性， 抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从 而提高了酶药效。
日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶 上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能 够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常 催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催 化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成， 已用于制造合成甜味剂。
1.1.3 酶的大分子修饰
分为大分子非共价修饰和大分子共价修饰两类
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相 互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、 右旋糖苷等．它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能 通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等 能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌 的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如 肽和聚胺)发挥作用的结果。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，因而 增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体 或酶聚合体的活力和稳定性比单体高
①烷基化试剂。烷基试剂中用得最多的是碘乙 酸、巯基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、碘乙酰胺。 E—SH+ICH2COOH → E—S—CH2COOH
②汞试剂。这类试剂如HgCl2、对氯汞苯甲酸 (pCMB)和2—氯汞硝基苯酚等。
③Ellman试剂。5，5’·二硫--二--（2—硝基苯甲酸) 是目前最常用的巯基修饰试剂，又称Ellman试剂， 还可用来测定酶蛋白巯基含量。
(2)氨基的化学修饰
①乙酸酐修饰
②2，4，6—三硝基苯磺酸修饰。
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应) Sanger反应的作用？
④氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、 芳香卤和芳香磺酸等。