植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化徐煜;蒋德意;韩迪【摘要】植物乳杆菌是一种具有多种生物活性的益生菌,其中缓解肌肉疲劳和损伤能力的运动保健功能引起了市场的关注,这与其谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的活力相关,目前尚缺乏对植物乳杆菌GS发酵工艺研究的报道.通过在培养基中添加L-谷氨酸、调整碳源以及改变金属离子质量浓度等方式提高植物乳杆菌Lp-G18发酵后的GS活力.得到优化培养基组成为:葡萄糖40 g/L(222 mmol/L)、七水硫酸镁4.92 g/L(20 mmol/L)、一水硫酸锰0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L(60 mmol/L)、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-801 g/L.采用优化培养基发酵得到的GS活力比原基础MRS培养基培养条件下的酶活力提高了1.4倍.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P13-17)【关键词】植物乳杆菌;谷氨酰胺;合成酶活力;发酵【作者】徐煜;蒋德意;韩迪【作者单位】润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436【正文语种】中文【中图分类】TS252.1乳杆菌是一类传统的、普遍被认为安全的益生菌，在酸乳、饮料、菌粉或泡菜中都有使用[1] 。
植物乳杆菌是常见的益生菌之一，具有良好的耐酸、耐胆盐能力，并具有许多益生功能，如调节肠道健康、抗氧化、抗真菌、预防便秘和腹泻、防治上呼吸道感染、抑制致病菌侵入和调节人体免疫等作用[2] 。
同时，植物乳杆菌还具有运动保健功能，具有缓解肌肉疲劳和损伤的能力[3] 。
植物乳杆菌缓解肌肉疲劳及损伤的能力与其谷氨酰胺的合成能力相关。
GS,GOGAT,GDH等酶活性测定最终版
提取方法2：Zhang CF, Peng SB, Peng XX, Chavez AQ,Bennett J. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice Oryza Sativa.L roots.Plant Sci,1997,125:163-170Rhodes D, Rendo GA, Stewart GR. The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L. Planta, 1975, 125:201-211The reaction mixture (3.0 ml) consistedof sodium ketoglutarate (10_mol), ammonium chloride(10_mol), calcium chloride (10_mol), NADH (2_mol), Tris–HClbuffer (100_mol, pH 8.2) and enzyme 0.1 ml.Following a 30 min incubation period at 30◦C in 20μmol MgSO4, 80μmol α-ketoglutarate, 6μmol hydroxylamine, 8μmol ATP and enzyme extract, the enzymatic reaction was terminated by the addition of 1.5 ml of a solution containing 0.37mol/l FeCl3, 0.2 mol/l TCA and 0.37 mol/l HCl andthe amount of glutamyl hydroxamate determined at 540 nm.Lea P J, Blackwell R D, Chen F L. Enzymes of primary metabolism. In: Harborne J B.Methods in Plant Biochemistry. Vol.3. New York: Academic Press, 1990. pp 260-273the reaction mixture (3 ml) consisted of 5μmo l α-ketoglutarate, 1μmol potassium chloride, 48.75μmol Tris–HCl buffer (pH 7.6), 0.6μmol NADH, 0.3 ml enzyme and 8μmol L-glutamine300μmol Tris–HCl buffer (pH 8.0), 600μmol ammonium chloride, 3μmol calcium chloride, 0.6μmol NADH, and 0.1 ml enzyme. The change of absorption value was detected at 340 nm in 3 min,Singh RD, Srivastava H S. Increase in glutamate synthase (NADH) activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant, 1986, 66:413-416Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Intracellular localization and properties of NADH–glutamate dehydrogenase form Vitis vinifera L.: Purification and characterization of the major leaf isoenzyme.Journal of Experimental Botany, 1990, 41:1223-1230EP酶活性的测定高玲, 叶茂炳‘ 张荣铣“ 徐朗莱, 小麦旗叶老化期间的内肤酶植物生理学报,1998,24（2）183-188硝酸还原酶活性的测定：仪器：离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等试剂：亚硝酸钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；磺胺；浓盐酸；萘基乙烯胺；KNO3K2HPO4·3H2O；半胱氨酸；EDTA；NADH（辅酶Ⅰ）；李合生主编，植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2000,125-127 Li H-S(李合生). Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry (植物生理生化实验原理和技术).Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 125-127 (in Chinese)关于您问的“磷酸缓冲液里该加多少EDTA和半胱氨酸，均没有说明”在此书的P126页写的很全面，步骤也非常详细，请查阅，如：提取缓冲液。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
GS和GOGAT酶活性测定
实验报告（修改中勿动）9月8日张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μm ol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml 的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）←以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
GS GOGAT 的测定
提取缓冲பைடு நூலகம்：
0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4 7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；
反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4 7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；
40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
请问反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；到底是加多少体积的盐酸羟胺啊？而且盐酸羟胺是酸性的，加进去PH肯定会变化。急！
反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；
显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：
3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3 6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；
二
三
四
五
六
七
八王月福
谷氨酰胺合成酶（GS）活性检测试剂盒说明书
BC0910 -- 第 1 页，共 3 页谷氨酰胺合成酶（GS ）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0910 规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体30 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂一 液体12 mL×1瓶 -20℃保存 试剂二 液体12 mL×1瓶 -20℃保存 试剂三 粉剂×2瓶 -20℃保存 试剂四液体15 mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：试剂三：临用前取一瓶加入5mL 蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。
产品说明：GS （EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
GS 在ATP 和Mg 2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm 处有最大吸收峰。
Glutamic Acid + NH 4+GlutamineGlutamine γ- Glutamyl Hydroxamic Acid Iron Hydroxamic注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
碳氮代谢测定
谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。
淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
生物化学酶习题及答案
第七章酶化学一、填空题1.全酶由________________和________________组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中________________决定酶的专一性和高效率，________________起传递电子、原子或化学基团的作用。
2.酶是由________________产生的，具有催化能力的________________。
3.酶的活性中心包括________________和________________两个功能部位，其中________________直接与底物结合，决定酶的专一性，________________是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。
4.常用的化学修饰剂DFP可以修饰________________残基，TPCK常用于修饰________________残基。
5.酶促动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法)，得到的直线在横轴上的截距为________________，纵轴上的截距为________________。
6.磺胺类药物可以抑制________________酶，从而抑制细菌生长繁殖。
7.谷氨酰胺合成酶的活性可以被________________共价修饰调节；糖原合成酶、糖原磷酸化酶等则可以被________________共价修饰调节。
二、是非题1.[ ]对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。
2.[ ]酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。
3.[ ]酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。
4.[ ]Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
5.[ ]当[S]>> Km时，v 趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加v。
6.[ ]酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间长，则最适温度高，作用时间短，则最适温度低。
7.[ ]增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。
谷氨酰胺合成酶(GS)检测
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谷氨酰胺合成酶（GS）检测
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）是高等植物氮代谢中的关键酶，能催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，参与氨同化过程，不仅可以防止铵离子过多造成的生物毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式，谷氨酰胺合成酶活性可作为衡量植物氮素同化水平的一项重要生理指标。
测定原理：谷氨酰胺合成酶在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨
酰胺，谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色
的络合物，产物在540nm处有最大吸收峰，通过吸光值的变化即可表征谷氨酰胺合成酶的活性。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测谷氨酰胺合成酶活性变化。
此外，我们还提供其他氮代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
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1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
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如何进行植物的营养生长监测
提高营养生长监测水平建议
加强技术研发
完善数据处理流程
加大科技投入，推动植物营养生长监测技 术的研发和创新，提高监测的精确性和实 时性。
建立完善的数据处理流程，提高数据处理 效率，提取有价值信息，为农业生产提供 科学决策依据。
推广先进监测设备
加强人才培养
积极推广先进的监测设备和技术，降低监 测成本，提高植物营养生长监测的普及率 和应用水平。
01
02
03
监测植物营养状况
通过定期监测植物叶片、 根系等部位的营养状况， 及时发现营养不足或过剩 等问题。
预防病虫害
营养生长监测有助于预防 因营养失衡导致的病虫害 ，保障植物健康生长。
调整生长环境
根据监测结果，及时调整 光照、温度、湿度等生长 环境，为植物提供最佳生 长条件。
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地理信息系统应用
将遥感数据与地理信息系统相结合， 实现植物营养生长的空间分析和可视 化表达，为精准农业管理提供决策依 据。
03 关键营养元素监 测技术
氮素营养监测技术
叶片氮含量测定
通过采集植物叶片样本，利用化学分析方法测定叶片中的氮含量， 以评估植物的氮素营养状况。
氮素快速测定仪
使用专业的氮素快速测定仪器，可以快速、准确地测定植物组织中 的氮含量，适用于田间实时监测。
回归分析
建立植物生长指标与营养成分 含量之间的回归模型，预测植 物的生长趋势。
结果解读
根据统计分析结果，对植物的 营养生长状况进行评估，找出
可能存在的问题和原因。
监测报告编写和汇报
报告编写
将监测结果、统计分析 结果等整理成报告，包 括文字、表格、图表等 内容。
报告审核
对报告进行审核，确保 内容的准确性和完整性 。
植物来源谷氨酰胺转氨酶的研究进展
植物来源谷氨酰胺转氨酶的研究进展李洪波;李金;张天琪;李红娟;于景华【摘要】植物来源谷氨酰胺转氨酶(TGase)是—种在植物中广泛存在的催化酰基转移反应的蛋白酶,已被证实具有不同的理化性质和生理功能.结合最新的研究,本文综述了植物来源TGase在不同组织、器官中的分布,性质及其在植物生长发育过程中起到的作用.同时,为了获得植物来源TGase进行功能特性及其在食品、医学和其它工业中的应用研究,本文介绍了植物来源TGase异源表达的研究进展,并为该方法的改进提出了建设性意见.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)016【总页数】5页(P336-339,345)【关键词】植物源 TGase;功能特性;异源表达;展望【作者】李洪波;李金;张天琪;李红娟;于景华【作者单位】天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】TS201.3谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)是一种催化酰基转移反应的酶,它能通过谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(氨基受体)和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供体)之间的酰基转移反应形成ε-(γ-谷氨基)赖氨酸异肽键,从而实现蛋白质分子内、分子间的交联[1]。
TGase的交联作用可以改善蛋白质的理化性质,进而影响其功能特性。
TGase在食品、生物医学、纺织等方面有着广阔的应用前景,其中食品行业的应用最受关注,这也进一步增加了对廉价、有效和安全TGase的需求[2-3]。
根据其来源不同,谷氨酰胺转氨酶大致分为以下三类:动物来源的谷氨酰胺转氨酶、植物来源的谷氨酰胺转氨酶和微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(MTG)。
水稻硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶测定
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植物谷氨酰胺合成酶(GS)说明书活性-贝洛生物科技有限公司
植物植物谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶(GS)酶联免疫酶联免疫分析分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围检测范围：： 96T1 IU/L -48 IU/L使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定植物组织，细胞上清及相关液体样本中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物谷氨酰胺合成酶(GS)水平。
用纯化的植物谷氨酰胺合成酶(GS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷氨酰胺合成酶(GS)，再与HRP 标记的谷氨酰胺合成酶(GS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷氨酰胺合成酶(GS)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物谷氨酰胺合成酶(GS)活性浓度。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（96 IU/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)
谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)简介：谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一，可以防止过多的铵离子对生物有毒性，在ATP 和Mg 2+存在下，谷氨酰胺合成酶催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，能催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，谷氨酰胺是氨的主要储存和运输形式。
Leagene 谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)检测原理是GS 催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，后者转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物，单位为μmol/(mg protein ·h)；也可间接用540nm 处吸光度的大小来表示，单位为OD/(mg protein ·h)。
该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中谷氨酰胺合成酶活性，尤其适用于植物体内谷氨酰胺合成酶的活，100T 检测试剂盒可以测定50次左右样本。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 离心管或试管3、 匀浆器或研钵4、 低温离心机5、 恒温箱或水浴锅操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：GS Lysis Buffer=比例，加入预冷的GS Lysis Buffer ，冰浴情况下充分匀浆或研磨，离心20min ，留取上清，即为谷氨酰胺编号 名称TE1103 100T Storage试剂(A): GS Lysis Buffer 250ml 4℃ 试剂(B): GS Assay Buffer 250ml 4℃ 试剂(C): GS 启动剂 10ml RT 试剂(D): ATP2支 4℃试剂(F): 蛋白标准(BSA) 20mg RT 试剂(G): G250染色液 100mlRT使用说明书1份合成酶粗提液，4℃保存待用，分别用于测定和对照。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-4℃保存，用于谷氨酰胺合成酶的测定。
谷氨酰胺合成酶测定
谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定一、实验原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1protein·h﹣1。
二、实验仪器与用具冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）三、实验试剂（1）提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0）。
内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；（2）反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。
称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；（3）反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）。
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；（4）显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）。
转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力
转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力【摘要】转PnAlaAT3基因是提高杨树在低氮条件下叶谷氨酰胺合成酶活力的重要因素。
本研究旨在探讨转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响及其在杨树生长过程中的意义。
经过一系列实验发现，转PnAlaAT3基因显著提高了杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，从而增强了杨树在低氮条件下的生长能力。
通过材料与方法、结果分析和讨论等部分对实验结果进行了深入阐述，并得出了结论：转PnAlaAT3基因能够有效增加杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，对杨树生长具有重要意义。
展望未来，本研究可为进一步优化杨树栽培提供理论依据。
实验结果表明，转PnAlaAT3基因是提高杨树在低氮条件下叶谷氨酰胺合成酶活力的有效途径。
【关键词】关键词：转PnAlaAT3基因、杨树、叶谷氨酰胺、合成酶活力、低氮条件、生长、研究、意义、结果分析、讨论、实验结果、结论、展望。
1. 引言1.1 研究背景转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力的研究背景：本研究旨在通过转PnAlaAT3基因的方式，探讨其对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响，以期为提高杨树在低氮条件下的生长适应性提供新的思路和方法。
通过这一研究，可以增加对杨树氮素吸收和利用机制的了解，为未来的遗传改良和育种提供参考和借鉴。
1.2 研究目的本研究的目的是探究转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响。
由于氮素是植物生长发育过程中必需的营养元素之一，然而在许多土壤中氮素含量不足，这对植物的生长和发育造成了影响。
了解植物在低氮条件下的适应机制对于提高植物的氮利用效率具有重要意义。
杨树是一种常见的速生树种，具有快速生长和较高的氮利用效率的特点。
本研究旨在通过转PnAlaAT3基因来提高杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，进而增强杨树在低氮条件下的生长适应能力。
通过研究转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响，可以为进一步优化杨树氮利用效率提供理论基础和实践指导。
GOGAT活性的测定
提取液同GSGOGA T活性的测定反应混合液包括0.4ml 20mmol／L的L-谷氨酰胺，0.5ml 20mm／L的α-酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，总体积3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)补足(1.5m1)。
反应启动后，用752外可见分光光度计于340nm处每30s测定1个消光值，连续测定10次，取光密度稳定减小的段来衡量酶活性。
一个GOGA T活性单位定义为在该反应条件下，每分钟反应混合液减少1μmolNADH为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的测定酶液的提取酮同GS。
活性测定参照Lin（1996）的方法，反应混合物中包括0.3ml0.1mMα－酮戊二酸，0.3ml1MNH4Cl，0.2ml3mMNADH和1ml酶提取液，不足的体积用0.2MTris-HCl buffer补足，反应由酶液启动，340nm下测定消光值的变化。
以每分钟0.001消光值的下降作为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的测定测活贮备液:115.4mmol/L Tris HCL(Ph8.0)，23.1mmol/L 2-酮戊二酸，231mmol/LnNH4CL。
NADH贮备液:6mmol/LCaCI:贮备液:30 mmol/L先在准备好的试管中加入2.6mL测活贮备液，按顺序加入0.1mLCaC12，0.lmLNADH，0.1mL 蒸馏水。
再加入0.1ml酶液启动反应，并于34Omn处测定吸光值，三分钟后再测定一次，计算差值。
以水代替NADH和酶液作为空白对照管。
NADH一GDH活性以每分钟在30℃下氧化1umol的NADH所需的酶量为为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性测定参照黄维南方法[6],并稍有修改。
反应体系中含有0.1 M Tris-HCl,pH 8.2, 0.33 Mα-酮戊二酸,3 M NH4Cl,1mM NADH。
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实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定
【原理】
谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】
冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】
提取缓冲液：
0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+
，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；
反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：
内含80mmol/L Mg 2+
，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；
反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A 的成分再加入80mol/L
盐酸羟胺，pH7.4；
显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
【方法】
1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。
2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。
3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。
4.原始数据记载
5.结果计算：
GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A
⨯⨯ 式中 A —540nm 处的吸光值；
P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。
可溶性蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝法
一、原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂
1、实验材料：植物叶片。
2、主要仪器
（1）分析天平、台式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞试管、试管架；（4）研钵；（5）离心机、离心管；（6）烧杯、量筒；（7）微量取样器；（8）分光光度计。
3、试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
（3）乙醇；
（4）磷酸（85％）。
四、操作步骤
1、标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。
其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。
吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。
以标准曲线1
号试管做空白。
五、结果计算
样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=(C×V/a)/W
式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V为提取液总体积（ml）；
A为测定所取提取液体积（ml）；
W为取样量（g）。