植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

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实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定

【原理】

谷氨酰胺合成酶(GS )是植物体内氨同化的关键酶之一,在A TP 和Mg 2+存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示,单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。

【仪器与用具】

冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml 、1ml )。 【试剂】

提取缓冲液:

0.05mol/L Tris-HCl ,pH8.0,内含2mmol/L Mg 2+

,2mmol/L DTT ,0.4mol/L 蔗糖。称取Tris (三羟甲基氨基甲烷)1.5295g ,0.1245g MgSO 4·7H 2O ,0.1543g DTT (二硫苏糖醇)和34.25g 蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0,最后定容至250ml ;

反应混合液A (0.1mol/L Tris-HCl 缓冲,pH7.4):

内含80mmol/L Mg 2+

,20mmol/L 谷氨酸钠盐,20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ,称取 3.0590g Tris ,4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐,0.6057g 半胱氨酸,0.1920gEGTA ,去离子水溶解后,用0.1mol/L HCl 调至pH7.4,定容至250ml ;

反应混合液B (含盐酸羟胺,pH7.4):

反应混合液A 的成分再加入80mol/L

盐酸羟胺,pH7.4;

显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液): 3.3176g TCA (三氯乙酸),10.1021g FeCl 3·6H 2O ,去离子水溶解后,加5ml 浓盐酸,定容至100ml ; 40mmol/L A TP 溶液:0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中(临用前配制)。 【方法】

1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中,加3ml 提取缓冲液,置冰浴上研磨匀浆,转移于离心管中,4℃下15,000g 离心20min ,上清液即为粗酶液。

2.反应 1.6ml 反应混合液B ,加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液,混匀,于37℃下保温半小时,加入显色剂1ml ,摇匀并放置片刻后,于5,000g 下离心10min ,取上清液测定540nm 处的吸光值,以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ,用水定容至100ml ,取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质(见实验28)。

4.原始数据记载

5.结果计算:

GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)=t V P A

⨯⨯ 式中 A —540nm 处的吸光值;

P —粗酶液中可溶性蛋白含量(mg/ml ); V —反应体系中加入的粗酶液体积(ml ); T —反应时间(h )。

可溶性蛋白质含量的测定

——考马斯亮蓝法

一、原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

二、材料、主要仪器和试剂

1、实验材料:植物叶片。

2、主要仪器

(1)分析天平、台式天平;(2)刻度吸管;(3)具塞试管、试管架;(4)研钵;(5)离心机、离心管;(6)烧杯、量筒;(7)微量取样器;(8)分光光度计。

3、试剂

(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL 蒸馏水中,即为1000μg/mL的原液。

(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置1个月。

(3)乙醇;

(4)磷酸(85%)。

四、操作步骤

1、标准曲线制作

(1)0~100μg/mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。

(2)0~1000μg/mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管,按表2取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1000μg/mL的标准曲线。

2、样品提取液中蛋白质浓度的测定

(1)待测样品制备:称取样品2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.5~1h以充分提取,然后在4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。

(2)测定:另取2支10mL具塞试管,按下表取样。吸取提取液0.1mL(做一重复),放入具塞刻度试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线1

号试管做空白。

五、结果计算

样品蛋白质含量(mg∕g鲜重)=(C×V/a)/W

式中:C为查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);

V为提取液总体积(ml);

A为测定所取提取液体积(ml);

W为取样量(g)。

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