结核分枝杆菌对于异烟肼耐药的分子机制研究进展

生相关。［8］
1 KatG（ 过氧化物酶） 基因 过氧化物酶（ katG） 是唯一能够激活异烟肼的酶，INH 进
入结核分枝杆菌细胞内，被 katG 激活氧化成异烟酸，异烟酸 作用于烯酞基还原酶，参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD，辅 酶 I） 的合成，干扰细胞壁中的分枝菌酸生物合成，使结核分 枝杆菌细胞壁的完整性及抗酸性受损。KatG 基因突变包括 完全缺失，点突变、碱基的插入和缺失，均可造成 KatG 基因 功能的下降 或 缺 失，势 必 影 响 KatG 对 INH 的 激 活，而 导 致 INH 耐药。 1. 1 KatG 基因部分突变： KatG 基因的突变是导致结核分枝 杆菌 INH 耐药主要成因，在耐药性相关的 katG 基因突变中， 基因 315 位氨基酸密码子突变的检出率最高，其中第 315 位 丝氨酸→苏氨酸（ Ser→Thr，AGC→ACC） 的突变频率最高。［9］ 此位点的基因突变使 katG 活性位点甲基化，因而其编码的过 氧化氢酶 － 过氧化物酶无法激活 INH，导致 INH 耐药［10］。有 研究报道 katG 基因 315 位点丝氨酸 →天冬酰胺 （ Ser→Asn， AGC→AAC） （ 18. 18% ，2 /11） ［11］，丝 氨 酸 → 异 亮 酰 胺 （ Ser → Ile，AGC→ATC） （ 2. 44% ，1 /41） 等等突变均可与异烟肼耐药 相关［12］。有研究对比了 katG315 位点基因突变发生率情况： 俄罗斯西北地区（ 93% ，191 /204） 、南非（ 64% ，80 /124） 、中国 （ 38. 6% ，39 /101） 印度（ 31% ，15 /49） 、新加坡（ 26% ，41 /160） 、 芬兰（ 7% ，4 /54） ［13］，KatG315 突变率差异可能是与所收集标 本来源的地域差别相关，另外标本量不足也会引起结果的误 差。有研究报道 KatG 第 329 位点基因突变天冬酰胺→缬氨 酸（ Asn→Val） ，该突变使重组 KatG 过氧化氢酶活性完全丧失 导致异烟肼耐药，这可能与天冬酰胺是极性、中性氨基酸，缬 氨酸是非极性、疏水性氨基酸，天冬酰胺→缬氨酸突变氨基酸 性质变化较大相关； 也可能与在分子结构中 329 位氨基酸的 位置相关［14］。异烟肼耐药菌株的 KatG 第 463 位点基因突变 精氨酸→亮氨酸（ Arg→Leu） ，有研究表明该突变并不改变过 氧化氢 － 过氧化物酶的活性，认为 KatG 基因中 Ｒ463 / L 突变 无意义［15 － 16］。因“主要多态性随机重复序列”引起 katG 基因 重排导致 katG 区域的不稳定而导致 katG 463 突变，该突变与 基因多态性相关。 1. 2 KatG 基因缺失： 仅有很小部分耐 INH 结核菌株 katG 基 因完全缺失，且该菌株对异烟肼高度耐药［17］。1992 年 Zhang 等发现高耐药性菌株（ M IC ＞ 50 pg / ml） 3 株［18］，完全为过氧 化氢酶阴性，有 2 株完全缺失 kat G 基因，提示是由于 katG 基 因的完全缺失导致其编码产物过氧化氢 － 过氧化物酶的活性 丧失造成对异烟肼高度耐药。KatG 是结核分枝杆菌的一种重
3 烷基过氧化氢酶还原酶（ ahpC） 基因和 oxyＲ 基因 在大肠杆 菌 和 鼠 伤 寒 沙 门 菌 等 天 然 抗 INH 的 细 菌 中，
oxyＲ 调节子突变对 INH 敏感性有影响。OxyＲ 蛋白是分枝杆 菌一种对抗氧化应激反应的的自我保护方法，OxyＲ 蛋白既是 过氧化物威胁的感应器，又可激活过氧化物毒性解除相关酶 的表达，而参与 katG、ahpC 基因的转录［23］。oxyＲ 基因中有很 多突变、缺失，其本质上没有活性，结核分支杆菌 oxyＲ 基因是 一个假基因，与 其 对 INH 敏 感 性 无 关［24］。AhpC 与 OxyＲ 邻 近，但转录方向相反； ahpC 基因启动子位于 oxyＲ － ahpC 基因 间区域，对于异烟肼耐药的结核分枝杆菌常发生此区域的突 变［19，25］。作为 KatG 活性缺失的补充机制 ahpC 基因突变时， 使烷基过氧化氢酶还原酶表达上调，能够部分或者完全弥补 了 oxyＲ 基因的缺陷，使细菌对 INH 产生耐药［26 － 27］。
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吉林医学 2Fra Baidu bibliotek14 年 5 月第 35 卷第 14 期
·综 述·
结核分枝杆菌对于异烟肼耐药的分子机制研究进展
薛 卉，秦 超，张彩莲 （ 天津市海河医院，天津 300000）
［关键词］ 异烟肼； 结核分枝杆菌； 耐药 我国耐药结核病疫情严重，一线抗痨药物异胭肼（ INH） 作为 DOTS（ 直接督导下短程化疗） 战略中重要组成药物已被 广泛应用于临床，而长期应用异胭肼可诱导结核分枝杆菌的 基因变异，使异胭肼耐药性大幅提高。研究表明结核分枝杆 菌中的过氧化氢酶 － 过氧化物酶（ katG） 、烯酰脂酰载体蛋白 还原酶（ inhA） 、β － 酮酰基酰基运载蛋白合成酶（ kasA） 、烷基 过氧化氢 酶 还 原 酶 （ ahpC） 、还 原 型 辅 酶 Ⅰ 脱 氢 酶 （ ndh） 和 oxyＲ 等等多基因突变与异烟肼细菌耐药性相关，结核分枝杆 菌对于异烟肼的耐药基因与耐药机制较为复杂，故将国内外 学者关于结核分枝杆菌对异烟肼耐药分子机制的研究情况作 一综述。 结核病迄今 仍 是 严 重 危 害 国 人 健 康 的 重 大 公 共 卫 生 问 题，我国是全球结核病高负担国家且耐药结核病疫情严重，每 年中国的结核病新发病例和耐多药结核（ MDＲ － TB） 病例数 均居世界第二位［1］。耐药尤其是耐多药结核分枝杆菌的出现 与传播，成为实现 2050 年控制结核病全球性目标的致命性威 胁［2］。异胭肼（ INH） 是 DOTS（ 直接督导下短程化疗） 战略中 的重要组成药物，也是应用最广泛的一线抗痨药物之一。异 烟肼在世界范围总耐药率 13． 3% ，中国总耐药率 18． 96%［3］， 故而对于异烟肼耐药及复敏的研究已成为当今热点。 异烟肼对于细 胞 内、外 的 生 长 繁 殖 代 谢 旺 盛 或 近 乎 于 静 止的结核分枝杆菌均有杀菌作用，对于主要见于 PH 中性的结 核空洞壁和空洞内的 A 群结核菌（ 快速繁殖菌） 作用最强［4］。 INH 能够渗入身体各组织内，在干酪样病灶、结核性浆膜腔积 液中药物浓度高，INH 易通过血 － 脑脊液屏障为结核性脑膜 炎首选抗痨用药。由于 INH 具有强效杀菌，不良反应少，具有 片剂、针剂剂型，使用方便，价格低廉等优势多年以来在临床 上被广泛应用。但有研究表明 INH 不同于其他抗痨药物，长 期使用可诱导结核分枝杆菌基因变异，从而大幅提高 INH 耐 药性［5］。关于异烟肼的耐药分子机制较为复杂，故将近年来 国内外学者研究情况作出综述。 INH 结构简单仅为一个酰肼基连接于一个吡啶环，INH 是一种前体药物，通过被动扩散的方式进入增长期的结核分 枝杆菌中［6］，进而被结核分支杆菌中的氧化氢酶 － 过氧化物 酶激活。INH 活化产生一系列的活性氧和活性有机自由基， 攻击主要为细胞壁中的分枝菌酸、也可能包括 DNA、脂类等 结核分枝杆菌的多个靶点［7］，造成被攻击蛋白靶点中的某些 基团氧化或酰化 ，使 其 一 些 生 理 功 能 丧 失 而 导 致 细 菌 死 亡 。 结核分枝杆菌中的过氧化氢酶 － 过氧化物酶（ katG） 、烯酰脂 酰载体蛋白还原酶（ inhA） 、β － 酮酰基酰基运载蛋白合成酶 （ kasA） 、烷基过氧化氢酶还原酶（ ahpC） 和还原型辅酶 Ⅰ脱 氢酶（ ndh） 等多基因突变有报道证实与异烟肼细菌耐药性产
4 ndh 基因等其他基因 还有许多基因被报道与结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性
相关，如 ndh、iniA、iniB、iniC、accD6、efpA、furA、nal 等等。其中 ndh 基因编码 NADH 脱氢酶，ndh 基因突变使 NADH 氧化受抑 制，以致 NADH 增多，NAD + 减少，NADH / NA D + 比例改变使 INH 过氧化被抑制而致耐药。上述基因大多与异烟肼耐药关 系尚不十分明确，分子细节尚不清晰，仍需进一步探索研究加 以证实。
总之，结核分枝杆菌对异烟肼耐药分子机制十分复杂，涉 及诸多基因突变，其分子细节及基因作用至今未能够完全阐 明尚存有争议，还 有 待 进 一 步 研 究 探 索。以 助 于 实 现 对 异 烟 肼耐药的结核分枝杆菌致病病例临床上能更快的诊断和更有 效的治疗控制。
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烯酰脂酰载体蛋白还原酶（ inhA） 和 β － 酮脂酰脂酰载体 蛋白合酶（ kasA） 属于Ⅱ型脂肪酸合酶（ fatty acid synthase Ⅱ， FAS Ⅱ） 系统，分别由 inhA 基因和 kasA 基因编码。FAS Ⅱ系 统多酶复合体与分枝菌酸的合成相关，分枝菌酸是结核分枝 杆菌细胞壁的关键成分，与枝菌酸长链脂肪酸合成和延伸相 关的酶学催化步骤是 INH 的攻击目标，故 INH 破坏了细胞 壁，细菌因耐酸性和疏水性丧失死亡。inhA 与 NADH 和 3 个 FAS － Ⅱ复合物结合，与 KasA，酰基载体蛋白 AcpM 形成共价 4 个亚基的复合体； 被活化的 INH 攻击于靶点后可使成熟的 枝菌酸不能产生，同 时 使 已 成 熟 的 枝 菌 酸 被 不 断 耗 尽。［19］ Inh A 和 Kas A 基因的共同过表达与异烟肼耐药相关，而 Inh A 表 达水平改变更能够影响 Kas A 表达水平［20］。InhA 活性位点 处的 NADH 与活化后的 INH 共价连接后，影响 InhA 还原酶活 性，起到阻碍分枝菌酸的生物合成杀菌作用； 而 INH 结构基因 突变则影响活化的 INH 与 NADH 的共价连接，从而破坏 INH 的作用产生耐药性［21］。KasA 和 acpM 基因分别编码码 β － 酮 脂酰脂酰载体蛋白合酶和酰基载体蛋白，活化的 INH 与这两 种蛋白共价连接，形成三元络合物 KasA － INH － AcpM，以阻 碍分枝菌酸生物合成； KasA 基因突变能够使 INH 与 KasA 和 AcpM 共价连接被破坏而致异烟肼耐药。［22］
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要防御性毒力决定因子，对细菌生存起到重要的作用，katG 缺 陷易受到宿主产生的氧化胁迫攻击，故 KatG 发生完全缺失的 概率极小。
2 烯酰脂酰载体蛋白还原酶（ inhA） 和 β － 酮脂酰脂酰载体 蛋白合酶（ kasA） 基因