拟南芥突变体的筛选与鉴定综述
拟南芥突变体的观察和鉴别
2.材料与方法1
2.1 材料 2.1.1 生物材料： 拟南芥野生型（Ler）种子 突变体（pid-2、scr-3）种子
表 1 全组移栽统计情况表
移栽植株总量/棵
126
成活植株总量/棵
86
成活率
不同品系植株总
Ler
量/棵
53
68% Pid-2
16
scr-3 17
3.3 发育 6 周各项指标数据处理 3.3.1 株高 以周一组数据为分析样本：
Ler 平均株高 X1 = 55.47 方差 S12 = 285.20 样本容量 53
3.结果
3.1 拟南芥发育各时期图
图 1 示拟南芥发育 2 周整体观2
图 2 示发育 6 周的 pid-2 突变体外观3
图 3 示发育 6 周 scr-3 品系外观4
3.2 发育 6 周植株数量统计
2 由于本人样品未拍摄，此图引自施逸豪同学的样品 3 引自标准图 4 引自标准图
3.2.1 个人移栽统计情况 本组共领取约 15 颗种子，移栽 11 颗种子，个人共计移栽 2 颗种子，在 2 周时成 活两棵，在 6 周时仅有 1 棵成活。品系为野生型。 3.2.2 周一组移栽统计情况
1 组，2 组，3 组的萼片数和雄蕊数均无差异。
3.3.3 花形态
对于第 1 组有 31 个正常，19 个不正常
对于第 2 组 0 个正常，15 个不正常 对于第 3 组有 5 个正常，10 个不正常5
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法随着生物技术的快速发展，从分子到基因组层面的遗传研究已经成为许多生物学实验室的重要研究方向。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是其中一种最常用的模式植物，它拥有许多基因遗传和发育过程的相似性，因此被广泛用于生物学研究。
本文将着重介绍拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法。
1. DNA转化和质粒构建在拟南芥基因研究中，DNA转化和质粒构建是十分重要的实验方法。
DNA转化即将外源DNA导入拟南芥细胞内，常使用的方法有冷冻处理法、电穿孔法等。
而质粒通常可以用于转化拟南芥细胞，以研究基因结构、调节元件、绿色荧光蛋白构建等。
2. 基因敲除基因敲除是在已知某个基因的功能和表达模式，并通过基因突变得以验证。
敲除分为生理性敲除和人工性敲除两种，其中后者可以通过质粒导入方法实现。
基因敲除在拟南芥遗传学研究中被广泛应用，可以探究基因对于生长发育过程的途径以及在各种逆境下的适应能力等。
3. 基因表达基因表达研究是在基因的各种调节元件上构建不同启动子，将被测量的基因与这些元件进行组合，从而研究基因表达的条件和模式。
例如通过全基因组转录组分析方法，可以了解到各种条件对基因表达的影响。
基因表达研究在植物逆境抗性和发育过程等方面都有广泛的应用。
4. 突变体筛选突变体是指基因序列中发生变异引起的表型重要变化，通常是由于自然或人为诱变引起。
突变体的筛选在拟南芥属植物分子遗传学中有着重要的地位。
目前已开发出几十种突变体筛选方法，包括靶向突变、随机诱变、胚乳培养及基因组分析等。
通过筛选突变体，我们可以了解到基因在植物生长发育中的重要性和相互间的关系。
5. 遗传交叉和构建突变遗传交叉是通过交叉杂交的方式寻找某一特定基因或显性性状的控制，以了解基因型和表型特征之间的关系。
而构建突变则是利用特定的载体将人工合成的单个核苷酸序列插入到目的基因中，从而创造特定的基因突变。
这些方法在研究基因调控途径、寻找新型基因等方面都有着重要的应用。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。
通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。
关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。
同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。
2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。
2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。
实验五 拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定
一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
三0ml反应体系二：
三0ml反应体系四：
二ml 植物基因组DNA样品[WT]
二ml 植物基因组DNA样品[一一一]
三ml 一0×扩增缓冲液
三ml 一0×扩增缓冲液
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
电泳检测
• 每个大组选两个人点样,电泳结果扫描保存, 下次课看结果,
• LBa一 of pBIN-pROK二 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
[一]取植物叶片[拟南芥一片叶子],置于一.五ml离心管中,加入四00 ml提取缓冲液;
[二]用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; [三]在台式离心机上一三000 rpm离心五分钟; [四]离心后将上清三00 ml转移至一个新的一.五 ml离心管中; [五]在上清中加入三00 ml异丙醇,混匀后于室温下一三000 rpm条
用无菌水补足体积,
PCR反应条件
八四℃ 三min 三0循环 [八四℃/一min,五五℃/一min,七二℃/一min]; 七二℃ 延伸一0min,
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整,
PCR安排
拟南芥隐性抗盐单基因突变体的筛选与鉴定
郭美丽：拟南芥隐性抗盐单基罔突变体的筛选与鉴定１．１２４抗氧化防御系统的活性Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ等ｐ“提出的自由基伤害学说，已广泛削于需氧生物细胞伤害机理的研究。
二十世纪８０年代以后，人们对盐分胁迫Ｆ植物体内抗氧化防御系统进行了大量的研究，并己确定它由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ｃＡＴ）和抗坏血酸（ＡｓＡ）等，它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害，而单一的抗氧化酶不足以防御这种氧化胁迫。
如ＳＯＤ催化两个超氧自由基发生歧化反应形成０２和Ｈ２０２，Ｈ２０２再被ＰＯＤ和ＣＡＴ催化除掉。
在整个氧化防御系统中，ＳＯＤ是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶。
根据结合金属离子的不同，ＳＯＤ可分为Ｃｕ／Ｚｎ—ＳＯＤ，Ｍｎ．ＳＯＤ和Ｆｅ—ＳＯＤ３种类型，Ｃｕ／Ｚｎ－ＳＯＤ主要存在与叶绿素和细胞质中，Ｍｎ．ＳＯＤ主要存在于线粒体中，Ｆｅ—ＳＯＤ主要存在与叶绿体中【３“。
一般来讲，在盐分胁迫下，植物体内的ＳＯＤ等酶活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关，而且在盐分胁迫下，盐生植物与非盐生植物相比，其ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ活性更高，因而更能有效地清除活性氧，阻抑膜质过氧化。
此外，在盐胁迫下，植物体内的某些过氧化物质，如抗坏衄酸也有清除体内自由基的生理功能。
刘婉等ｐ…认为，离体小麦叶片在盐胁迫加强条件下，体内抗坏血酸含量下降，用活性氧清除剂处理可明显缓解抗坏血酸含量下降，且外源抗坏血酸能明显缓解由盐胁迫造成的对细胞膜的伤害，降低ＭＤＡ含量，提高叶绿体的Ｈｉｌｌ反应活力、叶片光合速率和叶片线粒体呼吸速率。
可见ＳＯＤ和抗氧化物质等自由基清除系统对保护膜结构，提高植物耐盐性有～定作用。
１１．２．５盐胁迫蛋白研究发现，植物在盐胁迫Ｆ，体内合成一些新蛋白称为应激蛋白或胁迫蛋白，而且证明某些应激蛋白与植物的抗盐性有关。
Ｎ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ【４０】等首次报道了，在烟草盐适应悬浮细胞中存在盐胁迫蛋白，此后又发现在烟草、苜蓿、玉米、甜菜等许多作物中存在盐胁迫蛋白，而且尤以分子量为２６ｋＤ蛋白质的含量显著，可占总蛋白的１０％～１２％，且增加量与总蛋白置呈正相关Ｈ”。
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法拟南芥（Arabidopsis thaliana）是目前广泛应用于分子遗传学和突变体筛选的模式植物。
它具有小型体积、短生命周期、易于培养和遗传变异等优点，使其成为研究植物基因功能的理想模型。
下面将介绍拟南芥属植物的分子遗传学和突变体筛选研究方法。
一、拟南芥分子遗传学研究方法2. 基因组学方法：包括全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）、基因芯片（Microarray）和下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）等技术，用于分析和比较拟南芥基因组的序列、结构和功能。
3.双杂交法：通过构建酵母杂交系统，研究和鉴定拟南芥基因间的物理和功能相互作用关系，进而揭示拟南芥基因调控网络和信号转导途径。
4. RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术：利用沉默诱导的RNA （siRNA）或者镰刀状RNA（hairpin RNA）介导靶向基因的沉默，从而研究和验证拟南芥基因的功能。
二、拟南芥突变体筛选方法1. EMS化学诱变：使用化学诱变剂EMS（Ethyl methanesulfonate），处理拟南芥种子，让其发生突变，形成突变种子库。
进一步筛选和鉴定突变体，识别和研究拟南芥基因的突变功能。
2. 插入序列突变法：通过插入转座子（Transposon）或者T-DNA转座子，将外源序列插入拟南芥基因组，产生随机或特异性的基因突变，进行筛选和分析。
3.含有T-DNA插入的突变体库：使用含有T-DNA插入的突变体库，通过筛选和分离带有T-DNA插入的个体，鉴定和研究拟南芥基因的功能和表达调控。
4.突变体数据库查询：拟南芥基因突变体数据库中收集了大量已经鉴定和命名的突变体信息，可以通过数据库查询，寻找和鉴定具有特定表型的突变体。
拟南芥抗镧突变体的筛选及初步鉴定
微 量元 素 ： ｕ Ｏ Ｃ Ｓ ・５ ２ ０ ０ ５ ｇ・Ｌ‘） Ｍｎ １ Ｈ Ｏ（ ． ７ ｍ ‘ ， Ｃ：・
体 库 一 。 １ １３ Ｌ ” 溶液 ．． ａ 称取 １ １３ ａＯ， 上海 化 学试 剂 厂 ， ． ７ ｇＬ （
花科 植物 。拟南芥 具有个 体小 、 长周期 短 、 于 培养 、 生 易 种
子数 量多 、 因结 构简 单 且 基 因组 序 列 已经 全 部 测序 ， 基 研 究成 果易于转 化等 特点 ， 称 为植 物界 的“ 被 果蝇 ” 是一 种 ， 典型 的模式植 物 。Ｊ 。作 为模 式 植物 ， 南 芥更 为 重要 的 拟
Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｉ ｎ ｉ ｃ ｔＯｎ ０ ｎｔ ｎｕ — Ｒｅ ｉｔ ｃ ｒ ｉ ｐｓｓ Ｍ ｕ ａｎ ｓ ｌ ｔｏ ｎ ｄｅ ｔｆ ａ ｉ ｆＬａ ｈａ ｍ ｉ ｓｓａｎ ｅＡ ａｂｄｏ ｉ ｔ ｔ
Ｇ ＵＯ Ｆｅ ｔａＩ ｉｅ ．
（ ｎ ｕ Ａ ｒ ｕｔｒａ Ｕ ｉ ｒｉ ， ｅｅ ２ ０ ３ ， ｈｎ ） Ａ ｈ ｉ ｇｉ ｌ ｅｌ ｎｖ ｓ ｙ Ｈ ｆｉ ３ ０ ６ Ｃ ｉ ｃ ｕ ｅ ｔ ａ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
摘
要 ： 用 乙酰 甲基 磺 酸 （ ＭＳ 诱 变 方 法 ， 幼 苗 根 在 重 力 作 用 下的 弯 曲 生 长 为 指 标 ， 利 Ｅ ） 以 筛选 得 到 了拟 南 芥 抗 镧 突 变
体 。 通过 进 一 步使 用更 高浓 度 镧 对 获得 的 突 变体 进 行 复 筛 ， 步 确 定 了 Ｋ ＭＳ ６植 株 为拟 南芥 抗 镧 突 变 体 。 初 Ｅ 一３ 关 键 词 ： 南 芥 ； 镧 ； 变 体 拟 抗 突 中 图分 类 号 Ｑ ４ ．４ ． ９９ ７ ８３ 文献 标 识 码 Ａ 文 章编 号 １０ ０ ７—７ ３ （０ ０ ｌ — ９— ３ ７ １ ２ １ ） １ ４ ０
模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
4
模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
1
实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120
拟南芥ems诱变及突变体筛选
1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中 PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功 能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。 2、当Fv/Fm比值高于0.6时，则认为PSll下游电子 传递链复合物(包括PSI和细胞色素b6/f等)受到影 响。 3、当突变体的Fv/Fm降低到0.7左右，说明在突变 体中Psll内部的电子传递没有受阻，而可能是PSll 以后的Cytb6f或PSI复合物发生突变的结果。
• 植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于 还原状态，在650nm,光强为0.05o.1μmol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收 远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传 递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧 光值FO。施加单饱和脉冲(3000μmol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体 QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o) 上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化 学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转 化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84 之间。
100mmol/L磷酸缓冲液配置：
• 1、准备100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4; • 2、将70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在烧 杯中混匀； • 3、用KH2PO4将PH调到6.5； • 4、将1M的磷酸缓冲液稀释到100mmol/L。
突变体筛选
• 根据光合色素的改变来筛选叶色突变体 因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引 起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突 变性状,一般在苗期表达,但少数突变体直到发 育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是 直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿 素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也 多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从 苗期叶色来划分,如白化、黄化、浅色光成像系统对突变体进行筛选， 设定不同伪彩色参数挑选出Fo；Fm； Fv/Fm;NPQ变化的突变体。 室温状态下,暗适应后的突变体野生型各生 长时期植株用于分析。
《低钙敏感拟南芥自然变异种的筛选及相关基因的粗定位》范文
《低钙敏感拟南芥自然变异种的筛选及相关基因的粗定位》篇一摘要：本文针对低钙敏感拟南芥自然变异种进行了筛选，并对其相关基因进行了粗定位。
通过遗传学和分子生物学手段，分析了不同钙敏感度拟南芥种群的遗传差异，为进一步研究钙信号传导途径及钙相关基因的功能提供了重要依据。
一、引言钙是植物生长和发育过程中的重要元素之一，其参与了许多生物过程，包括细胞信号传导、基因表达调控等。
拟南芥作为一种重要的模式植物，在研究植物对钙的响应机制中具有重要地位。
近年来，在拟南芥中发现了不同钙敏感度的自然变异种，这些变异种为研究钙信号传导途径及相关基因功能提供了良好的材料。
本文旨在通过筛选低钙敏感拟南芥自然变异种，并对其相关基因进行粗定位，以期为深入解析植物钙信号的调控机制提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料实验所用的拟南芥材料为不同钙敏感度的自然变异种。
2. 方法（1）筛选低钙敏感拟南芥自然变异种：采用盆栽种植不同拟南芥种群，分别设置高钙和低钙两种处理条件，观察并记录其生长状况及表型变化，筛选出低钙敏感的变异种。
（2）基因组DNA提取与扩增：提取各变异种基因组DNA，利用PCR技术进行扩增。
（3）SNP检测与连锁分析：通过SNP检测技术对扩增的DNA片段进行基因型分析，确定各变异种的基因型差异。
利用连锁分析方法对相关基因进行粗定位。
（4）生物信息学分析：利用生物信息学软件对粗定位的基因进行注释、功能预测及互作网络分析。
三、结果与分析1. 低钙敏感拟南芥自然变异种的筛选通过对不同拟南芥种群在高低钙条件下的生长状况进行观察和比较，成功筛选出低钙敏感的变异种。
这些变异种在低钙条件下表现出明显的生长抑制和表型变化。
2. 基因组DNA的扩增与SNP检测成功扩增了各低钙敏感拟南芥变异种的基因组DNA片段，并通过SNP检测技术确定了各变异种的基因型差异。
结果显示，不同低钙敏感度拟南芥种群在特定基因位点上存在显著的SNP差异。
3. 相关基因的粗定位利用连锁分析方法对低钙敏感拟南芥相关基因进行了粗定位。
毕业论文-拟南芥突变体的鉴定 精品
拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。
核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。
这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。
组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。
早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。
然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。
其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。
在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。
我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。
并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。
利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。
给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。
关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。
染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。
组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。
尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。
然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。
这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。
铝不敏感型拟南芥突变体的特征分析及突变基因筛选
铝不敏感型拟南芥突变体的特征分析及突变基因筛选我国设施作物生产中土壤营养元素失衡,土壤呈现酸化趋势是一个较为严重的问题。
土壤酸化会增加可溶性铝的含量,抑制植物正常生长和损害其生理功能。
植物体内合成的铝激活苹果酸转运蛋白(ALMT1)能促进根系苹果酸的分泌,从而缓解植物受铝离子的胁迫。
因此ALMT1在调节苹果酸分泌和植物对铝胁迫耐受的过程中起着关键作用。
为深入研究植物耐铝基因ALMT1表达的调控机制,本研究通过诱导获得对铝胁迫不敏感的拟南芥突变体,鉴定和筛选参与铝胁迫信号转导和AtALMT1表达转录因子的相关基因。
主要研究结果为:利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导携带绿色荧光蛋白(GFP)AtALMT1启动子的转基因拟南芥,使其产生突变且引起AtALMT1的表达异常,筛选出7个对铝不敏感的拟南芥突变体。
通过对比铝离子胁迫拟南芥突变体与野生型的表型差异,发现突变体在根和下胚轴生长上受抑制的程度不同,其中MDI下胚轴长度受到显著抑制,MD4、MD5、MD6、MD7则显著抑制根系生长,而MD2和MD8未能观察到生长明显受抑制。
通过检测7个突变体的苹果酸释放量、AtALMT1表达量及铝胁迫相关基因(CAMTA2、STOP1、ALS3、MATE)的表达量,发现除MD5以外,其它突变体中苹果酸的分泌量明显降低,AtALMT1的表达量也有不同程度下降。
根据前人有关铝诱导拟南芥AtALMT1的表达归类为早期调控和晚前调控两个阶段,本研究筛选的铝敏感型突变体MD4、MD6、MD7归类为早期调控,MD1、MD2、MD5、MD8归类为晚期调控。
在吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)处理下,突变体的AtALMT1表达量受到不同程度抑制,其中突变体MD4、MD6、MD7与IAA诱导型表达相关,MD1、MD4、MD6与ABA诱导型表达相关。
分析铝离子处理下突变体的转录组,结果显示参与铝胁迫信号转导和转录因子活性调控的ALS3、MATE、PLT3、SULTR3等基因在MD4和MD5中被抑制,这与野生型和STOP1突变体有明显的差异。
拟南芥基因突变体筛选和分类的研究
拟南芥基因突变体筛选和分类的研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物研究中的常用材料，因其具有许多优点：生长快、体形小、基因组测序完成、适应广泛等等。
而生物学研究中最为基础的就是基因研究，因此引发人们对拟南芥基因的探索和研究。
本文将会介绍拟南芥基因的突变体筛选和分类的研究。
一、拟南芥的基因突变体筛选在拟南芥中，基因突变体是非常重要的，由于拟南芥基因组的测序已经完成，因此，科研人员可以利用现代高通量筛选技术，来快速建立大规模的拟南芥基因突变体资源库。
1.1 传统筛选法最常用的传统筛选方法是化学诱变、X射线、γ射线和紫外线辐射等方法，其基本原理是：通过人为或其他因素对植物种子或幼苗进行处理，使其基因发生变异，最终产生突变体。
其中，化学诱变是使用化学物质诱导植物基因发生变异，这种方法有较大优势，因为可以在不依赖实验室设备的情况下大规模筛选。
但是，化学诱变方法可能会引起伪突变和失败的突变率较高。
1.2 高通量筛选法随着科学技术的发展，高通量筛选方法得到了广泛应用，尤其是基于基因编辑技术的筛选方法。
目前流行的高通量筛选法有：T-DNA插入、CRISPR/Cas9、RNA干扰等。
其中，T-DNA插入是在拟南芥基因组中随机插入T-DNA，每个T-DNA都能够导致拟南芥基因表达的改变。
因此，T-DNA插入是一种高效、简单、易于筛选和操作的方法，并且在拟南芥研究中应用广泛。
二、拟南芥基因突变体分类拟南芥基因突变体分类是指将筛选得到的突变体按照突变部位和性质分为不同的类型，以方便基因功能的研究和应用。
2.1 快速分离突变位点的方法首先，需要快速、准确地确定突变体的位点，以此进行后续的基因功能分析，现在，基因突变体的位点鉴定方法已经得到了较大的改进，常见的方法包括PCR-RFLP、dCAPS和PCR-sequencing等。
其中，PCR-RFLP是一种快速、简便的检测方法，基本原理是：通过PCR扩增突变体和野生型基因区段，然后将PCR产物限制性酶切，从而分辨突变体和野生型基因。
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本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。
在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。
在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。
概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。
总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。
关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。
它是分子生物学研究的模式植物，它的完整基因组已被成功测定。
近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。
拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。
鉴于拟南芥在遗传操作上所具有的优势，它已广泛应用于植物整个生命活动各个过程的研究，为新基因及基因功能等方面的研究提供了很多依据。
1. 拟南芥抗旱突变体的筛选张娇娇[1]在拟南芥突变体的筛选研究中采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫，以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体，筛选出2株候选突变体，最终得到1株稳定突变体vem1，通过表型和生理生化鉴定，确定为抗旱突变体。
该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。
实验所用拟南芥（Arabidopsis）生态型为Columbia，野生型(WT)和突变体（Mutant）来自美国拟南芥种质资源中心[2]，实验采用2种方法培养植株[3-4]。
分别是培养基培养与土壤培养，而培养基培养的方法是将种子经0.1％Hgcl2消毒3min后，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子点种在加入1.5％蔗糖和0.8％琼脂的培养基中；并用封口膜封装于4℃条件下处理2d后转至光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2温度22～23℃的培养室。
土壤培养是将幼苗移至装有混合好的灭菌营养土的盆钵中，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内，移栽和开花时各浇1次营养液，并根据植株生长需要浇以适量水。
土壤培养是将种子播种于装有灭菌土的盆钵中，浇含有不同浓度甘露醇的营养液，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内培养。
确定抗旱突变体的筛选浓度将野生型拟南芥种子分别点在甘露醇浓度为250、300、350、400mmol/L的MS培养基上，每个浓度3个培养皿，每个培养皿中播种50粒种子，成5×10矩阵，水平放置培养。
经过4℃冰箱黑暗2d春化、光照培养7～10d后，记录发芽率。
以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的甘露醇浓度为临界筛选浓度。
再以确定的筛选浓度配制培养基进行筛选。
培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。
定期观察并拍照，若有能生长的突变体幼苗，作为候选突变体，将之移栽到土壤中培养。
2. 拟南芥耐硒突变体的筛选慈凌坤[5]在拟南芥耐硒突变体筛选研究中采用不同质量浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)对拟南芥突变体库中的2121株拟南芥进行筛选,筛选出29株候选突变体，最终得到2株稳定突变体vse1和vse2，通过表型鉴定和生理生化鉴定确定是突变体。
该研究为耐硒基因克隆及功能分析奠定了基础,对于揭示植物耐硒的分子机理具有重要的理论意义。
实验所用材料是拟南芥(Arabidopsis)生态型为Columbia,野生型(WT)和突变体(Mutant)来自美国拟南芥种质资源中心。
实验采用2种方法培养植株：①培养基培养:种子经0.1%HgCl2消毒3min后用无菌水冲洗4～5次，将种子点种在1.5%蔗糖和0.8%琼脂的培养基中；并用封口膜封装,于4℃条件下处理2d后转至光照为100μmol·m-2·s-2 、温度为22～23℃的培养室中。
②土壤培养：种子播种于装有土壤的盆钵中，置于光周期为光照16h, 黑暗8h、光照为100μmol·m-2·s-2 、温度为22～23℃的培养室内, 播种和开花时各浇1 次营养液, 并根据植株生长需要浇以适量水。
通过培养实验确定50mg/LNa2SeO3为筛选质量浓度后。
在普通MS培养基上点种，育苗7d后移入50 mg/LNa2SeO3选择培养基，以根长作为筛选指标,选择根长明显长的作为候选突变体。
3. 拟南芥耐低钾突变体筛选3.1 不同钾浓度的低倍钾对拟南芥生长的影响蒋春运[6]为了探讨筛选耐低钾突变体的最优条件，比较了5种琼脂粉(糖)及不同钾浓度的低钾培养基对拟南芥生长的影响。
结果表明:添加Seakem LE agarose 培养基的钾离子浓度为43.07Lmol/L；钾离子浓度在60、80、100、120、160μmol/L 时,拟南芥弯根长度显著或极显著高于在40Lmol/L时，因此40Lmol/L左右可作为耐低钾突变体的筛选标准。
植物材料为Wassileskija生态型的拟南芥。
基本培养基为1/2MS培养基，筛选培养基为含有不同琼脂粉(糖)的MS低钾培养基和含不同钾离子浓度的MS培养基。
5种琼脂粉(糖):Agar D、Agar B 为Bio Basic USA Inc 生产，普通琼脂粉为北京奥博星生物技术有限责任公司生产，Seakem LE agarose为瑞士Lonza E生产,Invitrogenagarose 为美国invitrogen生命技术公司生产。
在实验过程中首先要对种子消毒、播种与培养条件次氯酸钠表面消毒15min(期间多次颠倒混匀)，再用无菌水冲洗5～6遍。
播种前种子与0.15%(m/v)琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出,成行地播种于1/2MS 培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化2d,之后转入培养室中光照培养，培养皿垂直放置。
待根长至2cm 时,将拟南芥幼苗转移至相应的低钾培养基上倒置培养，观察拟南芥根的弯曲情况。
培养室温度22～24℃，照条件：16h光照,8h黑暗,光强100μmol·m-2·s-2。
不同品牌的琼脂粉(糖)钾离子含量的测定方法5种不同琼脂粉或琼脂糖各称取0.25g放进坩埚中,在马弗炉中首先在300℃中灰化2h，然后再500℃灰化10h，灰分用硝酸溶解,加纯净水定容到10mL，用火焰光度计进行钾离子含量的测定。
每个样品3个重复。
拟南芥根生长测定方法将根长2cm的拟南芥幼苗分别转移到含有5种琼脂粉(糖)的低钾培养基上，培养基中的钾由琼脂粉(糖)提供。
倒置培养,培养条件同上。
10d之后观察测定幼苗的弯根长度，比较拟南芥在不同琼脂粉(糖)低钾培养基上的生长情况。
每处理3个重复，每个重复16株拟南芥幼苗。
根据上述结果选择合适的琼脂粉(糖)用于配制低钾培养基，外加KNO3调节钾浓度，分别配成总钾离子浓度为40、60、80、100、120、140、160、180μmol/ L的低钾培养基。
将根长2cm的拟南芥幼苗从1/2MS培养基转移到含不同钾离子浓度的低钾培养基上,倒置培养，6d之后统计幼苗弯根长度。
每个浓度处理3次重复，每个重复16株幼苗。
3.2 利用甲基磺酸乙基（EMS）处理拟南芥种子赵淑清[7]利用经甲基磺酸乙酯( EMS)诱变处理的拟南芥种子，接种于MS培养基上，垂直放置培养4天后,将幼苗转移至胁迫培养基中，以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体利用这种方法，成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。