8讲第2节-动物细胞大规模培养技术

MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。
3.转化细胞
转化细胞：正常细胞由于受到病毒或其他促癌因子 的诱导而变成了具有癌细胞属性的细胞。特点如 下： 无限增殖能力
密度抑制丧失 血清依赖性降低
形态学改变：可悬浮生长 核型改变：非整倍体 细胞膜功能改变：运输能力增加、对化学致癌物抵 抗力增加
致瘤性
1896
1920
1987
2006
第四篇 生物制品生产 第8讲 动物细胞生物制药 第2节 动物细胞大规模培养技术
为什么进行动物细胞大规模培养
1962年开始动物细胞大规模培养尝试，目前 已经成为生物制药的重要支撑技术。
本讲主要内容
1.适合大规模培养的细胞株 2.动物细胞培养的生物反应器 3.微载体及其培养特点 4.动物细胞培养的影响因素与培养工艺
不能连续培养的为有限细胞系(Finite cell line)，能连续培养下去的为连续细胞系 (Infinite cell line)。
（二）细胞株(Cell strain) 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离 培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细 胞群，称细胞株。 细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细 胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。 毛细管法 ------形成单个细胞克隆的细胞群体 有限稀释法
3.良好的传质性能
4.强的机械性能：重复利用、保护细胞 5.好的热稳定性：高压灭菌
制备微载体的材料
1.人工合成聚合物 聚甲基丙烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰 胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。 2.天然聚合物及其衍生物 明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐
4.接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率 较高。
（二）动物细胞培养的影响因素
1.细胞凋亡
（1）有毒物质或抑制因子产生 氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长。 乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵 解，能量产生减少，抑制细胞生长。 甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在 的损伤作用。 （2）营养成分耗尽 如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦 发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞 在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为 脆弱，更容易发生凋亡。 （3）其他物理因素 渗透压、pH、温度、载体、搅拌等
柱式中空纤维生物反应器
板框式
中心灌流式
特点
模拟细胞在体内生长的三维状态。 既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培 养。细胞如果是附壁性的，则附着在纤维外壳表 面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲 出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在 反应器内而让培养液排出。 优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。 缺点：容易堵塞，价钱昂贵。
常用细胞株
CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国仓鼠卵巢 分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也 可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能 力。 CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活 剂(Tissue plasminogen activator，tPA)、促红细胞生 成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原 （Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）、粒 细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。
1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产 脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物 制药的先河。 具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等缺点。 药物筛选、药理研究。
2.传代细胞
二倍体细胞：具有正常细胞的特点：二倍体染色体、 具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。 有限细胞 系（传代次数一般都不超过50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人的 正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。 培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生 产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫苗 （脊髓灰质灭活疫苗）生产。
生物因素：如毒素、黄曲 霉毒素、病毒SV40、EB病毒、 多发瘤病毒、逆转录病毒等。
2）细胞系筛选 诱变剂（致癌物）处理后的细胞群中进入转化发展阶段 的细胞仅是一小部分（大约5%），这些细胞称为癌前 细胞。 癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖速度变快 ，在局部癌前细胞的数量增多而堆积，最后形成了明 显 可见的“转化灶”。 “转化灶”进行克隆分离和纯化后， 继续扩大培养， 即可形成稳定的传代细胞系。
1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。 微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立 体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。 同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞 大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴 壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。
微载体特点
1.好的生物相容性：无毒无害，有好的黏附性，一 般带正电荷 2.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一
本讲关键问题
1.了解动物细胞转化方法 2.了解适合动物细胞大规模培养的生物反应器
3.重点掌握微载体培养技术 4.了解动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺
第一部分 细胞株与生物反应器
一 适合大规模培养的细胞株
（一）细胞系(Cell line) 是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细 胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群 体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。
转化细胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。 一般转化细胞并不致瘤。 致瘤性评价：接种到动物体内，发展形成肿瘤结 节，为生瘤阳性。 随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20 世纪80年代获得批准用于生产。
转化方法
（1）细胞自转化
细胞体外培养时，由于环境因子因素的影响，有时会发 生自发转化，由原来的二倍体核型变成多倍体/异倍 体核型，而获得永生化，失去接触抑制，可无限繁殖 传代。
（1）微载体培养
微载体培养动物细胞经黏附贴壁、生长和扩展成单层 三个阶段。
细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微 载体表面的贴附是关键。
黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载 体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概 率和亲和性，也与培养基组成、搅拌等相关。
影响贴壁的因素
贴壁主要是靠静电引力和范德华力。取决于细胞与 微载体表面理化性质和微载体接触概率有关。
由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等， 与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构 设计以及特殊载体的选择。
问题：
1.如何设计生物反应器，降低动 物细胞培养的剪切力损伤？ 2.1.动物细胞培养的生物反应器
机械搅拌式：浆叶改造
充气搅拌式：需要改造
微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培养 中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、 连续灌注培养
笼式鼓气生物反应器
气泡用丝 网隔开，不与 细胞直接接触。 反应器既能保 证混合效果又 有尽可能小的 剪切力，以满 足细胞生长的 要求。
机械搅拌结合鼓气的生物反应器
这种类型的生 物反应器搅拌速 度一般都非低， 尽量减少剪切力 对细胞的影响。
比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体的细胞称亚二倍体
BHK-21细胞（Baby hamster kidney cell）：是 1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样 ，异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白( 例如重组凝血因子VIII)。
Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿 猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴 壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之 一。
（三）适合工业化生产的细胞株
根据不同的分类标准，可以分为：
1.原代细胞、传代细胞 2.有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想 的药物生产细胞） 3.二倍体细胞、异倍体细胞 4.融合细胞、转化细胞、基因工程细胞
5.贴壁型、非贴壁型
1.原代细胞
鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞
可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污 染等，均有可能失去正常细胞特性，而发生遗传变异 甚至发生转化。因此为了维持二倍体细胞的正常细胞 特性，防止遗传变异和转化，应尽量早期冻存和减少 传代。
（2）人工诱发转化
1）诱发
采用诱导剂使正常细胞发生转化。 物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等 化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7，12-二 甲基苯醌 （DMBA）、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌（MMS）、乙基 亚硝基脲（ENC），甲基硝基亚硝基胍类化合物 （MNNG）等。
功能材料2004，35卷，增刊
微载体分类
1.实心微载体 优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高，容易 接种操作 缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅拌、 碰撞等影响；细胞易老化脱落。
2.多孔微载体 优点：比表面积更大，使细胞免受机械损伤，得 到的细胞浓度高，可降低血清用量，可以采 用高的搅拌速度和通气量 缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副产物。
电荷：一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。 若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞 贴壁速度。
培养基组分：添加血清有助于细胞贴壁。提供促接 触和伸展因子。 搅拌：不能仅依靠大的搅拌速率保证接触概率。在 贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后， 待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转 速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢， 最大速度75r/min。 其它因素：培养基偏酸或偏碱、微载体不洁等不利 条件都不利于细胞贴壁。
一种微载体产品（Fibra-Cel）
人胚肾细胞HEK293
人上皮细胞—— SoloHill微载体上的生长