--实验四目的基因的PCR扩增及扩增产物回收
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2. 相关基础知识
1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳 定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离 的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成 为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作 装 置 ， 使 PCR 技 术 进 行 实 用 阶 段 。 1993 年 度 ， Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得 诺贝尔化学奖。
11
引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适 温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷 酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分 钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液 的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所 以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的 温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长 度将延伸时间控制在1～7min。
聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段
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1.实验目的和要求
学 习 和 掌 握 PCR 基 因 扩 增 的 原 理 和 操 作 方 法 ， 并 深 刻 理 解 PCR 基 因 扩 增 技 术在DNA操作中的重要性。本实验以 含 有 小 鼠 的 基 因 （ 暂 定 T10 ） 的 质 粒 pCMV-Myc-T10 为 模 板 ， 扩 增 出 约 800bp的产物。
12
寡核苷酸（dNTP） 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制
Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在
非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高 浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低， 势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为 50 ～ 200μM ， 不 能 低 于 10 ～ 15μM 。 四 种 dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高 或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低 合成速度，过早终止反应。
9
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
10
引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异 性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩 增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物 与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引 物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温 度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融 解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公 式进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒 即可完成。
4
原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃ ）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA 模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分 双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合 成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延 伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过 一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条 双 链 DNA 分 子 。 如 此 反 复 进 行 ， 每 一 次 循 环 所 产 生 的 DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条 人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后 ，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106 ～107倍。
5
2）PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、
模板DNA、缓冲液。
6
引物：
要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶 DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物 间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。 由于引物是决定PCR扩增片段长度、位 置和结果的关键， 因此，引物设计也 就更为重要。
13
Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出 来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所 用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。由于 DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的 差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导 致非特异产物的增加。
3
PCR 的特点及应用：
PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。
1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、Hale Waihona Puke Baidu供大量DNA用于测序等；
2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
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引物的设计： 1. 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过
30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时 可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶 切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特 殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4 个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端， 即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱 基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” （Primer dimer）。 3. (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相 同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽 量相似。 4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其 是发夹结构（hairpin structures）。
2. 相关基础知识
1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳 定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离 的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成 为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作 装 置 ， 使 PCR 技 术 进 行 实 用 阶 段 。 1993 年 度 ， Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得 诺贝尔化学奖。
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引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适 温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷 酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分 钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液 的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所 以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的 温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长 度将延伸时间控制在1～7min。
聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段
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1.实验目的和要求
学 习 和 掌 握 PCR 基 因 扩 增 的 原 理 和 操 作 方 法 ， 并 深 刻 理 解 PCR 基 因 扩 增 技 术在DNA操作中的重要性。本实验以 含 有 小 鼠 的 基 因 （ 暂 定 T10 ） 的 质 粒 pCMV-Myc-T10 为 模 板 ， 扩 增 出 约 800bp的产物。
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寡核苷酸（dNTP） 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制
Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在
非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高 浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低， 势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为 50 ～ 200μM ， 不 能 低 于 10 ～ 15μM 。 四 种 dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高 或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低 合成速度，过早终止反应。
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引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
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引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异 性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩 增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物 与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引 物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温 度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融 解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公 式进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒 即可完成。
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原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃ ）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA 模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分 双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合 成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延 伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过 一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条 双 链 DNA 分 子 。 如 此 反 复 进 行 ， 每 一 次 循 环 所 产 生 的 DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条 人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后 ，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106 ～107倍。
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2）PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、
模板DNA、缓冲液。
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引物：
要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶 DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物 间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。 由于引物是决定PCR扩增片段长度、位 置和结果的关键， 因此，引物设计也 就更为重要。
13
Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出 来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所 用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。由于 DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的 差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导 致非特异产物的增加。
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PCR 的特点及应用：
PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。
1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、Hale Waihona Puke Baidu供大量DNA用于测序等；
2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
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引物的设计： 1. 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过
30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时 可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶 切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特 殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4 个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端， 即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱 基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” （Primer dimer）。 3. (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相 同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽 量相似。 4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其 是发夹结构（hairpin structures）。