--实验四目的基因的PCR扩增及扩增产物回收
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用课件
实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用
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延伸
延伸反应通常为72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最适反 应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为 TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。延伸反应时 间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中， TaqDNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会 导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适 当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一 步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产 物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
模板上的目的序列通过氢键配对; • 延伸(延长): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用
下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制 链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍。
实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用
2
PCR体系基本组成成分
模板DNA或RNA
特异性引物: sense和 antisense
Taq酶：耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+
PCR缓冲液： 10mmol/LTris-HCl pH8.4
50mmol/L KCl
Mg2+
0.1mg/mL乙酰B实S验A四PCR技术在动物传染病诊断中的作用
辅助软件：primer5，Oligo，DNAsis等
实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用
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PCR基因扩增及扩增产物的回收
聚合酶的活性。
模板的量：不能太多，100l反应体系中约100ng
4. dNTPs
dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称，一般 反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L，浓度 过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率
5. Mg2+ 的浓度
Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。所以Mg2+浓度 不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）， 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。
模板
引物
ACGTACGTA 5’
DNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板
上延伸DNA链。
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
72 ℃
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA
5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
变性—复性—延伸
1个循环的结果
TGCATGCAT 3’
3’ TAGAACTTG
ACGTACGTA 5’
DNA模板与引物复性(退火）: 引物Primer，人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序 分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同 模板
5’ ATCTTGAAC
引物
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
40-65 ℃ 5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
新一轮循环
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA
PCR的特点
特异性强：① 特异的DNA引物。 ② 高温下进行延伸 敏感性高: 理论上只要一条模板链， 32次循环就可合成约109条！ 快 简 速:整个PCR过程约2～4小时 便:对模板的纯度要求低 模板种类多样化
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
生物化学资料网
五、思考题
生物化学资料网
如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
生物化学资料网
实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
生物化学资料网
ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
分离目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。
通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。
二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。
实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。
2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。
3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。
4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。
四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。
2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。
（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。
（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。
3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。
（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。
4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。
（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。
（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。
五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。
2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。
PCR详细
30 s
30 s 1 kb/min 5 min 25-35个循环
备注：* 比两条引物的Tm值低5~10℃。
PCR产物电泳鉴定
凝胶准备 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE；
② 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；
③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 5μl，并轻轻混匀。 胶床准备
dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP） 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑 制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减 少在非靶位臵启动和延伸时核苷酸错误掺 入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓 度太低，势必降低反应物的产量。PCR常 用的浓度为50～200μM，不能低于10～ 15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任 何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶 的错误掺入，降低合成速度，过早终止反 应。
PCR缓冲液: 用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris – HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。在 72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位， 接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要， 影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+ 优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易 生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量 降低。首次使用靶序列和引物结合时，都 要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1～10mmol/L。
修复机制，所以，在PCR产物扩增以后，仍要分析其与模板DNA的是否完全一致。
最好的方法是将PCR产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。
/Blast.cgi
核酸序列比对
BLAST分析界面
输入测序结果
实验四 PCR扩增目的基因
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 • 体外程序化的DNA合成技术。 devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
3. Mg2+：
Mg2+ 浓度对 Taq DNA 聚合酶影响很大，它可影响酶 的活性和真实性，影响引物退火和解链温度 , 影响产物 的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范 围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少 有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等 可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ in the range of 100-300 bp long.
PCR扩增
PCR特点及应用
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
PCR应用
• • • • • • • 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents • 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases • 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA • 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations
目的基因扩增实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的方法，广泛应用于分子生物学领域。
目的基因扩增实验是分子生物学实验中的一项基本技能，通过PCR技术可以将微量的目的基因片段扩增到足够数量，便于后续的基因克隆、基因表达、基因测序等研究。
本实验旨在通过PCR技术扩增目的基因片段，并对扩增结果进行鉴定。
二、实验目的1. 掌握PCR技术的基本原理和操作步骤；2. 学会设计引物和优化PCR反应条件；3. 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR试剂盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、上下游引物、10×PCR缓冲液等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、恒温水浴箱等；3. 实验耗材：无菌离心管、DNA纯化柱、琼脂糖凝胶、电极等。
四、实验方法1. 引物设计：根据目的基因序列，设计特异性引物，确保扩增片段长度适中，避免非特异性扩增。
2. PCR反应体系配置：按照PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液等。
3. PCR反应程序：根据实验目的和引物Tm值，设计合适的PCR反应程序，通常包括预变性、变性、复性、延伸等步骤。
4. PCR反应：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，按照预定的PCR反应程序进行扩增。
5. 琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物条带。
6. 结果分析：根据电泳结果，判断目的基因是否成功扩增，并分析扩增产物的大小和纯度。
五、实验结果1. 电泳结果：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到目的基因片段的条带，其大小与预期结果相符。
2. 结果分析：根据电泳结果，可以确定目的基因成功扩增，扩增产物大小为预期值。
六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是PCR实验成功的关键因素之一，需要根据目的基因序列设计特异性引物，避免非特异性扩增。
实验4转基因植物PCR基因扩增及电泳检测
实验4转基因植物PCR检测四、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测一、实验目的1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。
2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、原理PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。
由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一，而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。
故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。
三、试验材料提取的甘薯基因组DNA。
四、试剂4.1 PCR反应引物序列35S：5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3，//5，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，；NOS：5，-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3，//5，-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3，。
4.2 PCR反应试剂：无菌去离子水；模板DNA；20 μmol / LPCR 引物；5U/μL Taq DNA 聚合酶；2.5 mmol / L dNTPs；10×PCR 缓冲液；25 mmol / L MgCl2，25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白4.2 核酸电泳相关试剂（见实验6）五、仪器5.1 PCR扩增仪。
5.2 微量移液器。
5.3 吸头。
5.4 电泳仪。
5.5 电泳槽。
5.6 凝胶成像仪。
5.7 PCR管。
六、实验步骤6.1 转基因植物PCR基因扩增6.1.1.1 按待检样品数（每一个样品分设35S和NOS两个检测反应）并加空白对照、阴性对照、阳性对照，取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管，按下表用记号笔在管壁上编号：6.1.1.2 之后按上述顺序依次加入各PCR反应液。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
PCR 产物回收
PCR产物回收一实验目的要求学生掌握PCR产物回收实验过程。
二实验原理本试剂盒采用新型硅基质膜技术，通过快速，简单的结合-洗涤-洗脱步骤可从大量普通或低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化50•bp-50•kb 的DNA 片段，溶胶速度快，每个吸附柱最高可吸附30• μg 的DNA，纯化过程中有效去除引物、核苷酸、酶、矿物油、琼脂糖等杂质，获得高纯度，完整性好的DNA 片段，回收率高达90%。
本试剂盒回收纯化的DNA 可直接用于测序、连接和转化、酶切、标记、体外转录等分子生物学实验。
•三操作步骤•1. 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量。
••注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。
•2. 向胶块中加入3倍体积Buffer• PG；当琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积Buffer• PG（如凝胶重为100• mg，其体积可视为100•μl，依此类推）。
•3. 50℃孵育10分钟，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。
•注意：1）在胶充分溶解后检测pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10-30•μl•的3•M醋酸钠（pH•5.0）将pH值调到5-7。
•••• 2）胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA 的能力较弱。
4. （可选步骤）当回收片段<500• bp或>4• kb时，应加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀（如凝胶为100• mg，则加入100•μl异丙醇）。
•注意：当回收片段为500•bp-4•kb时，加入异丙醇不会影响回收率。
•5. 柱平衡：向已装入收集管（Collection•Tube）中的吸附柱（Spin•Column•DL）中加入200• μl•Buffer•PS，12,000•rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
-PCR基因扩增及扩增产物的回收ppt课件
避免连续相同碱基排列或内部回文序列
5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC 3’
发卡结构
CTGCCAGTCTAC 3’ T GACGG 5’
2.4 避免形成引物二聚体（dimer）
两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列
primer1 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
ACGTACGTA 5’
模板
DNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板 上延伸DNA链。
模板
5’ ATCTTGAAC Taq
72 ℃
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq ACGTACGTA 5’
模板
变性—复性—延伸
1个循环的结果
1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa 1251 aaggatcgat taccgaacag ctgcttaacg ctcgtgccga cgttacgctt
1301 ggcggcggcg caaaaacctt tgctgaaacg gcaaccgctg gtgaatggca 1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac aggcacaggc gcgtggttat cagttggtga 1401 gcgatgctgc ctcactgaat tcggtgacgg aagcgaatca gcaaaaaccc
使PCR成为实用的方法
DNA模板高温变性: 双链DNA在受热后，配对碱基 的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
pcr扩增实验报告
pcr扩增实验报告篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA 的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
目的基因扩增实验原理
目的基因扩增实验原理一、引言目的基因扩增实验是一种常用的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增出目的基因，为后续的研究提供了便利。
本文将介绍目的基因扩增实验的原理及其应用。
二、PCR技术PCR技术是目的基因扩增实验的核心技术，它是一种体外扩增DNA的方法。
PCR技术利用DNA聚合酶在一定条件下，将DNA模板的两条链分离，并在模板的两端引导引物的作用下，合成新的DNA链。
PCR技术可以在短时间内扩增出目的基因，具有高效、快速、灵敏等优点。
三、目的基因扩增实验原理目的基因扩增实验的原理是利用PCR技术扩增出目的基因。
PCR技术需要引物，引物是一种短的DNA序列，它可以与目的基因的两端互补结合，作为PCR反应的起始点。
PCR反应需要模板DNA、引物、聚合酶和反应缓冲液等组分。
PCR反应的过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性是将DNA模板的两条链分离，退火是引物与模板DNA的互补结合，延伸是聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
PCR反应的循环次数越多，扩增的DNA量就越多。
四、目的基因扩增实验应用目的基因扩增实验在生物学研究中有着广泛的应用。
例如，可以利用PCR技术扩增出病毒、细菌等微生物的DNA，用于病原体的检测和鉴定；可以利用PCR技术扩增出人类基因组中的某些基因，用于疾病的诊断和治疗；可以利用PCR技术扩增出植物基因组中的某些基因，用于植物的遗传改良等。
五、结论目的基因扩增实验是一种常用的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增出目的基因，为后续的研究提供了便利。
PCR技术是目的基因扩增实验的核心技术，它具有高效、快速、灵敏等优点。
目的基因扩增实验在生物学研究中有着广泛的应用，可以用于病原体的检测和鉴定、疾病的诊断和治疗、植物的遗传改良等。
实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其 次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
三、仪器、材料与试剂
(一)仪器 1．微波炉 2．琼脂糖凝胶电泳系统 3．移液器 4．凝胶成像系统
(二)试剂
1．（1）5×TBE (50倍体积的TBE贮存液）配1000 mL 5×TBE Tris 54 g 硼酸 27.5 g 0.5mol／L EDTA 20 mL pH 8.0 或（2） 50×TAE(50倍体积的TAE贮存液） Tris 242 g 乙酸 57 mL 0.5mol／L EDTA 100 mL pH 8.0 2．凝胶加样缓冲液(6x) 3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子
筛效应,DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电 荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结 构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等 量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向 移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度 取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一 样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子 质量的对数值成反比关系。
高酸中和至中性高酸中和至中性变性的染色体dna与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物变性的染色体dna与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒dna又恢复天然构型溶解在上清液中纯化rna酶消化除去rna并用酚抽提法除去残留的蛋白质?sds是一种阴离子表面活性剂它既能使细菌细胞裂解又能使一些蛋白质变性所以是一种阴离子表面活性剂它既能使细菌细胞裂解又能使一些蛋白质变性所以sds处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁的破裂从而使质粒处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁的破裂从而使质粒dna以及基因组dna从细胞中同时释放出来
生物实验4 实时定量PCR 实验报告
实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。
按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。
注意，每次稀释都要换Tip头。
2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。
3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、104、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。
向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。
4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。
分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。
将加好样的8联管振荡。
5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。
--实验四目的基因的PCR扩增及扩增产物回收
保护性碱基 HindIII
Myc tag
Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝ 4×12＋2×11＝700C.
Primer 2(From T10 1249-1270):
5’TCG C GG ATC CAG TGG CAT CAG AGA CTT GCT AAT C 保护性碱基 BamH I
Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C.
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PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一 般是循环次数过多，非特异性背景严重， 复杂度增加。当然循环反应的次数太少， 则产率偏低。所以，在保证产物得率前提 下，应尽量减少循环次数。
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3）PCR扩增过程
在微量离心管中加入适量缓冲液、微量 模 板 DNA 、 四 种 脱 氧 单 核 苷 酸 （ dNTP ） 和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物， 并有Mg2+ 存在。其循环的温度取决于引 物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐 热性。
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(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下 （90℃-95）变性，双链解链；
(2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物 在 低 温 （ 35 － 65℃, 一 般 低 于 模 板 Tm 值的5℃左右），与模板DNA互补退火 形成部分双链；
(3) ，在 Taq酶作用下，以dNTP为 原料，引物为复制起点，模板DNA的 一条双链在解链和退火之后延伸为两 条双链。
加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超
过95℃。
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PCR缓冲液:
用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris –HCl 缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl。在72℃时， 反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。 二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异 性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无 任何作用。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物， Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引 物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度 变化范围为1～10mmol/L。
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寡核苷酸（dNTP） 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制
Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在
非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高 浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低， 势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为 50 ～ 200μM ， 不 能 低 于 10 ～ 15μM 。 四 种 dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高 或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低 合成速度，过早终止反应。
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引物的设计： 1. 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过
30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时 可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶 切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特 殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4 个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端， 即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱 基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” （Primer dimer）。 3. (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相 同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽 量相似。 4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其 是发夹结构（hairpin structures）。
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Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出 来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所 用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。由于 DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的 差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导 致非特异产物的CR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。
1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等；
2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
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引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
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引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异 性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩 增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物 与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引 物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温 度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融 解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公 式进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒 即可完成。
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原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃ ）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA 模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分 双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合 成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延 伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过 一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条 双 链 DNA 分 子 。 如 此 反 复 进 行 ， 每 一 次 循 环 所 产 生 的 DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条 人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后 ，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106 ～107倍。
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2）PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、
模板DNA、缓冲液。
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引物：
要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶 DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物 间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。 由于引物是决定PCR扩增片段长度、位 置和结果的关键， 因此，引物设计也 就更为重要。
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2. 相关基础知识
1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳 定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离 的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成 为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作 装 置 ， 使 PCR 技 术 进 行 实 用 阶 段 。 1993 年 度 ， Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得 诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段
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1.实验目的和要求
学 习 和 掌 握 PCR 基 因 扩 增 的 原 理 和 操 作 方 法 ， 并 深 刻 理 解 PCR 基 因 扩 增 技 术在DNA操作中的重要性。本实验以 含 有 小 鼠 的 基 因 （ 暂 定 T10 ） 的 质 粒 pCMV-Myc-T10 为 模 板 ， 扩 增 出 约 800bp的产物。
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引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适 温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷 酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分 钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液 的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所 以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的 温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长 度将延伸时间控制在1～7min。