啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究

№.6 陕西科技大学学报 Dec.2007 Vol.25 J OU RNAL OF SHAANXI UN IV ERSIT Y OF SCIENCE&TECHNOLO GY ・41・3　文章编号:100025811(2007)0620041204

啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究

毛跟年,张晓霞,张云丽,遆艳萍

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安　710021)

摘　要:以废弃的啤酒酵母为原料,采用超声辅助的方法对其中的AD H进行了提取.实验考

察了料液比、啤酒酵母用量、p H、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度对AD H提取效果

的影响,进一步通过L9(33)正交试验对AD H的提取工艺进行了优化,得到了啤酒废酵母中

AD H提取的最优方案为p H值8.5、超声功率320W、超声时间10min,在此条件下所得的

AD H活力可达1806U/mL.

关键词:啤酒废酵母;乙醇脱氢酶;提取

中图分类号:Q554+.9 文献标识码:A

0　引言

乙醇脱氢酶(AD H)属氧化还原酶第一亚类,作用于-CHO H基团,是以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶,催化伯醇和醛之间可逆反应的一种含锌金属酶,为胞内酶[124],已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域.目前商品AD H多来源于动物肝脏,提取纯化工艺比较成熟,但其资源有限且价格昂贵,远远不能满足市场的需要,而啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量的AD H.本文主要研究了从啤酒废酵母中提取AD H的工艺,为拓宽AD H的来源、降低AD H的生产成本提供了新的途径.

1　材料与方法

1.1　材料与设备

(1)啤酒废酵母:由西安汉斯啤酒厂提供.

(2)药品试剂:辅酶Ⅰ(NAD+)(Sigma公司生产),磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂.

(3)仪器设备:H H22超声波细胞粉碎机(国华电器有限公司)、T G L216G台式离心机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、UV29100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)等.

1.2　实验方法

1.2.1　AD H活性测定

AD H活性测定采用Vallec2Hoch法[5].将0.1mL AD H酶液与3mL p H为8.5的磷酸盐缓冲液混合,于37℃水浴预热5min,然后加入0.4mL的2M乙醇和0.1mL的4.5mM NAD+溶液,37℃水浴反应5min,立即置于沸水中灭活,于340nm波长处检测吸光度值.空白对照用蒸馏水代替加NAD+,其余均相同.

AD H酶活力(U/mL)定义:将AD H在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛,即还原NAD+为NAD H,在340nm处测定的吸光度变化0.001作为一个活力单位(U).

1.2.2　AD H的提取方法

3收稿日期:2007-09-17

作者简介:毛跟年(1962-),男,陕西省泾阳县人,教授,研究方向:生物制药

陕西科技大学学报第25卷

啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩,与一定体积的磷酸盐缓冲液混合,再在低于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎,每超声1s 间歇3s ,10000r/min 离心15min ,上清液在340nm 波长处测定吸光度值,计算AD H 活力.1.2.3　AD H 提取工艺的单因素实验

在AD H 提取实验中,固定其他条件,以提取液中AD H 活力为指标,分别对料液比、样品处理量、提取液p H 、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察,以确定各影响因素的适宜水平.1.2.4　AD H 提取工艺的正交试验

在单因素实验的基础上,选择对AD H 提取效果影响较大的因素,以提取液中AD H 活力为指标,按照正交试验原理进行正交设计,每个水平设3个重复,对正交试验结果进行直观分析和极差分析,以确定啤酒废酵母中AD H 提取的最优方案.2　结果与讨论

2.1　不同因素对啤酒废酵母中AD H 提取效果的影响2.1.1　料液比的确定

表1　样品处理量对AD H 提取效果的影响

啤酒废酵母/g

磷酸盐缓冲液/mL AD H 活力/(U/mL )

1020

2040

350466

在细胞超声破碎工艺中,提取液用量一般为样品处理量的3～5倍.但本实验通过对不同料液比下所得的AD H 活力进行比较,最终确定以啤酒废酵

母量(w )∶提取液(v )为1∶2较为适宜.主要是由于实验所用材料为啤酒厂废弃的啤酒酵母,成分比

较复杂,酵母菌体数量相对较少.选用较高的料液比例有利于提高单位提取液中AD H 的含量.2.1.2　样品处理量对AD H 提取效果的影响

分别取10g 和20g 啤酒废酵母,按照1∶2的比例用p H 为8.5的0.01mol/L 磷酸盐缓冲液对AD H 进行超声辅助提取,超声波功率250W ,超声全程时间10min.提取液中ADH 活力的测定结果见表1.

由表1可以看出,采用10g 和20g 啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时,AD H 活力分别为350U/mL 和466U/mL ,后者不仅提取出的AD H 活性高,而且一次可以获得较多的粗酶液,故后续实验

中均采用20g 的样品处理量

.

图1　p H 对AD H 提取效果的影响 图2　超声波功率对AD H 提取效果的影响

2.1.3　p H 值对AD H 提取效果的影响

取20g 啤酒废酵母,用不同p H 的磷酸盐缓冲液对AD H 进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图1所示.由实验结果可知,啤酒废酵母中AD H 提取的适宜缓冲液p H 范围为8.5

～9.5,在此范围内AD H 活性最高,升高或降低缓冲液的p H 值均可导致AD H 活力降低.2.1.4　超声波功率对AD H 提取效果的影响

将20g 啤酒废酵母用p H 为8.5的磷酸盐缓冲液在不同功率的超声波下进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图2所示.由实验结果可知,适宜于啤酒废酵母中AD H 提取的超声功

率在320W 左右.超声波功率不同,AD H 的提取结果差异较大.AD H 为胞内酶,较低的超声波功率无法

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