植物凝集素的分离纯化及部分性质测定

第11周 2011-5-3/4

植物凝集素的分离纯化及部分性质测定

分离纯化工艺策略：

主要是根据物质的结构和性质来选用各种纯化技术。工艺次序的选择策略包括：

1.应选择不同机理的分离单元组成一套工艺；

2.应将含量多的杂质先分离出去；

3.尽早采用高效分离手段；

4.将最昂贵、最费时间的分离单元放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段主要目的是尽量缩小样本体积，提高目的物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）；

5.随后是高分辩率的操作单元，如具有选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以使分离效益大大提高。色谱分离的次序。一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤之间的过渡。

如：

◇在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的交换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强。

◇凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。总之，蛋白质的纯化大至步骤为：样品经初步提取筛除部分杂质后，选择不同的层析手段相互配合进一步提纯。

第一部分离子交换层析

1. 原理：

离子交换层析（Ion-exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对各类化学物质或生物大分子因电荷差异而产生不同的结合力，从而将混合物中不同组分进行分离的层析技术。

Cation exchanger（阳离子交换）: 层析介质本身带负电荷,交换带正电荷物质

Anion exchanger （阴离子交换）:层析介质本身带正电荷,交换带负电荷物质–当缓冲环境 pH > pI, 蛋白质带负电

–当 pH < pI, 蛋白质带正电

–当pH = pI, 蛋白质不带电

–以阳离子交换树脂交换分离蛋白质的原理和方法为例: 将阳离子交换树脂（本身带负电荷）颗粒填充在层析管内，带正电荷的蛋白质(pH

引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也

不同。然后再用含阳离子（如Na+)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗

脱下来，增加Na+浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质

被分开。

2.实验室常用介质：

离子交换介质：适用于分离蛋白质等生物大分子与水的亲和力较大，载体孔径大

弱阳离子交换剂弱阴离子交换剂

CM-Cellulose DEAE-Cellulose

羧甲基-纤维素二乙基氨基乙基-纤维素

CM-Sephadex DEAE--Sephadex

羧甲基- 葡聚糖凝胶二乙基氨基乙基- 葡聚糖凝胶

CM-Sepharose DEAE-Sepharose

羧甲基- 琼脂糖凝胶二乙基氨基乙基- 琼脂糖凝胶

CM-Sepharose 和 DEAE-Sepharose由于性价比最高，因此作为实验室最常用的离子交换树脂

3.实验操作：

在这一部分中，本实验分别选用CM-Sepharose阳离子柱和 DEAE-Sepharose阴离子柱对学生的生物化学知识实践能力进行考查及训练。待纯化样品已经过初步提纯，具体操作步骤如下：

（1）用缓冲液平衡，经过至少5-6个柱体积的缓冲液平衡，使整个层析体系（包括层析柱里的凝胶和各仪器之间连接的管道）达到目标pH和离子强度，为下一步上样做准备。CM-Sepharose阳离子柱使用pH5.0,20mM的NaAc-HAc缓冲液；DEAE- Sepharose阴离子柱使用pH9.0,50mM的Tris-HCl缓冲液

（2）蛋白粗提液上样，缓冲液平衡后，使之前用缓冲液透析过（pH和离子强度和缓冲液相同）的蛋白样品通过层析柱；根据前面所述的层析介质结合原理，在这一过程中在pH9.0条件下带负电荷（蛋白PI<9.0）的蛋白结合在阴离子交换树脂上；在pH5.0条件下带正电荷（PI>5.0）的蛋白则结合在阳离子交换树脂上。为满足上述条件的蛋白随缓冲液流出层析柱。

（3）洗脱，选择适当盐（NaCl）浓度的缓冲液上柱，由于Na+或H-可以蛋白竞争性的结合在阳离子或阴离子交换树脂上，从而使之前结合在树脂上的带电蛋白质脱离下来。盐离子浓度越高这种效应就越明显，因此随盐离子浓度的变化收集不同时期的洗脱蛋白，从而达到对不同蛋白组分的分离效果。

（4）层析柱再生，收集完相应的蛋白溶液后，可对层析柱进行清洁再生，一般使用0.5M NaOH +1M NaCl的洗柱液再生柱子，操作方法如前，横流过3-4个柱体积，使残留于柱上的蛋白迅速脱离。

（5）高水清洗，经过洗柱液清洗的层析柱不能在高碱和高盐环境中长期保存，因此需用纯水清洗，使柱内环境恢复到pH电中性

（6）从上述第2步开始实时检测样品的凝血活性，以判断目的蛋白的分离效果和所在的组分。从上样起就可以紫外检测仪检测蛋白样品的过柱情况。

4.注意：

（1）选择适宜的交换剂

阳离子交换剂：DEAE-、 Q-

阴离子交换剂：SP-、CM-

（2）选择短而粗柱子，交换剂量根据上样量确定

（3）Buffer的确定、平衡与流速

阳离子交换剂对应Anion Buffer

阴离子交换剂对应阳离子Cation Buffer

样品体系要与上样Buffer一致

（4）对样品的体积没有严格限制，但在体积较大时应考虑样品浓度是否会超出层析柱中填料的载量

（5）上样Buffer的离子强度通常不大于0.1M

（6）洗脱方式通常采用盐浓度连续梯度或阶段梯度洗脱

（7）柱子可再生重新利用

（8）通常用20% 乙醇+ 0.03%NaN3保护长期不用的柱子，避免柱内滋生细菌等微生物（9）层析过程中避免层析柱中进入气泡，使柱压增大并且影响样品分离效果