SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml)
浓缩胶(5%.3ml)
H2O
2.6ml
Acr
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
30%, 1.7ml
0.7ml 10%, 1.5ml
Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml
根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，
二. 实验原理
• SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别
是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个：
1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于
1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一. 实验目的
• 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。
• 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS的性质与作用
十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+
SDS的性质与作用
Protein Strand
Denature
-
SDS Molecules
-
SDS的性质与作用
蛋白质变性
0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇 蛋白质变与SDS分子按比例结合 1 ：1.4
插入样品梳加入电极缓冲加入电极缓冲液液ph83ph83浓缩胶浓缩胶ph86ph86通电通电分离胶分离胶ph88ph88加入样品加入样品上样及电泳开始电流恒定在开始电流恒定在10ma10ma当进入分离胶后改为当进入分离胶后改为20ma20ma溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时停止电泳
SDS-聚丙烯酰胺
制备浓缩胶
加入浓缩胶溶 液 pH 8.6
分离胶 pH 8.8
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
上样及电泳
加入样品
浓缩胶 pH 8.6
开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA， 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶
pH 8.8
凝胶板剥离与染色
电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
凝胶电泳
生化社团 吕炎
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
测定蛋白质分子量
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果分析 五、注意事项
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的 操作技术。
二、实验原理
SDS的性质与作用 聚丙烯酰胺凝胶的性质
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
实验目的：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离蛋白质并测定分子量。
实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法，可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。
在本实验中，通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中，以使蛋白质带有几乎相同的负电荷，通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动，最终被染色，进行分离鉴定。
实验步骤：
1.准备实验材料：SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。
2.制备SDS-PAGE电泳凝胶：按照说明书，将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间，使其柔软。
3.制备电泳缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、glycine和SDS等物质，配制电泳缓冲液，使其达到所需浓度。
4.制备试样缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质，配制试样缓冲液。
5.制备样品：取适量的蛋白质样品，在试样缓冲液中煮沸一段时间，使蛋白质分子展开。
6.装样：将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。
7.电泳：按照说明书，调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件，开启电泳装置，进行电泳操作。
8.染色：将电泳板取出，进行荧光染色或银染色法。
9.图像处理：使用图像分析系统或其他软件，进行蛋白质条带的分析和图像处理。
实验结果：经过SDS-PAGE电泳后，样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带，通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。
根据蛋白质的分子量大小，可以判断样品中含有哪些蛋白质。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量实验数据：标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条溴酚蓝前沿距离/cm 4.70距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16样品 1 2 3溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37标准曲线：y=5.05-1.10x结果：样品 1 2 3Mr 12706 59566 43954mr 4.104 4.775 4.643一. 实验目的和要求1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2 掌握垂直板电泳的操作方法。
3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
sds-page测定蛋白质的相对分子量
03 SDS-PAGE测定蛋白质相 对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率 与其相对分子量成反比，即相对分子 量越大，迁移速度越慢。
在电场的作用下，SDS将蛋白质分子 包裹起来，消除了蛋白质分子间的电 荷差异，使相对分子量成为影响迁移 率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加 样孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳，注意控制电流 和电压，确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后，将凝胶取出，放入含有染色液的容器中，染色一定时间，以便观 察蛋白质条带。
脱色
染色完成后，将凝胶取出，放入含有脱色液的容器中，脱色一定时间，以便观 察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中，以促进蛋白 质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性，并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到玻璃板中 的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水，使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响，以 确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中，应将未使用的样品保存在低温环境中，以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性，影响实验结果，因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子 量范围的蛋白质，从低到高均可。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。
SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。
蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。
测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。
在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。
染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。
另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一,实验目的 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 聚丙烯酰胺凝胶电 掌握 泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE , )的工作原理和操作方法
二,实验原理 不同蛋白质具有不同的分子量, 不同蛋白质具有不同的分子量,并在 一定的pH溶液中带有不同的电荷 溶液中带有不同的电荷. 一定的 溶液中带有不同的电荷.但 经过SDS处理后的蛋白质,分子表面 处理后的蛋白质, 经过 处理后的蛋白质 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量 大小而与其所带电荷的性质无关. 大小而与其所带电荷的性质无关.
6. 上样:将样品梳拔出,用电极缓冲液 上样:将样品梳拔出, 冲洗样品孔. 冲洗样品孔.样品与样品缓冲液按一 定比例混合好. 定比例混合好.用微量注射器加入加 样孔,加样量为20l. 样孔,加样量为 . 7.电泳:100V恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 电泳: 电泳 恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 到浓缩胶和分离胶界面, 到浓缩胶和分离胶界面,然后调电压 至120V,再恒压电泳,约1.5 h,待染 ,再恒压电泳, , 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 停止电泳.取下胶板, 停止电泳.取下胶板,将胶片置于白 瓷盘内. 瓷盘内.
4. 制备浓缩胶:待胶凝固后(胶与水之间有 制备浓缩胶:待胶凝固后( 一清晰界面), 将水倒掉, 一清晰界面), 将水倒掉,用ddH2O冲 冲 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 倒入浓缩胶插好样品梳, 倒入浓缩胶插好样品梳,注意避免气泡滞 留在梳子与胶液的界面, 放置约15 留在梳子与胶液的界面,30 ℃放置约 min,直至使浓缩胶凝固. ,直至使浓缩胶凝固. 5. 电泳:将胶模装好,去胶条后,装入电泳 电泳:将胶模装好,去胶条后, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板 矮板在内). (矮板在内).
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质实验报告
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质实验报告实验报告：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质1. 实验目的：本实验旨在使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行分离和测定，并研究样品中蛋白质的分子量。
2. 实验原理： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测定方法。
在此方法中，蛋白质样品首先与SDS（十二烷基硫酸钠）反应，使蛋白质在电泳过程中带有负电荷。
然后，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，经过电泳分离。
由于SDS的作用，蛋白质在凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
最后，通过染色或蛋白质标记物检测，可以确定蛋白质的相对分子量。
3. 实验步骤： a. 准备SDS聚丙烯酰胺凝胶：按照制备凝胶的方法制备所需的聚丙烯酰胺凝胶，包括配制凝胶溶液、注射样品孔和负载样品等步骤。
b. 样品制备：将待测蛋白质样品加入SDS缓冲液，并加热至高温，使蛋白质与SDS反应，使其带负电荷。
c. 电泳操作：将样品加载到凝胶中，连接电源进行电泳，设定合适的电压和时间进行分离。
d. 染色和可视化：电泳完成后，将凝胶染色以可视化蛋白质条带，常用的染色方法包括银染、共染等。
e. 分析和测定：根据标准蛋白质的移动距离和相对分子量，通过比较和分析样品中蛋白质的相对分子量。
4. 实验结果：在实验中，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和染色，观察到样品中的蛋白质条带。
根据标准蛋白质的移动距离和相对分子量，可以推断样品中蛋白质的相对分子量。
实验结果可以用图表形式展示，包括蛋白质条带的位置和相对分子量的估计。
1/ 25. 结果分析与讨论：分析实验结果，比较样品中蛋白质的相对分子量与已知标准蛋白质的相对分子量之间的差异。
根据条带的位置和相对分子量的估计，可以推断样品中的蛋白质组成和含量。
讨论实验中可能出现的误差和不确定性，并提出改进的建议。
6. 结论：根据实验结果，可以得出关于样品中蛋白质的相对分子量和组成的结论。
总结实验的目的、方法和结果，并指出实验的局限性和未来的研究方向。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
03 结果分析
CHAPTER
蛋白质分子量的计算
蛋白质分子量计算
根据已知标准蛋白的迁移率和分子量 ，通过线性回归分析，计算未知蛋白 的分子量。
校准曲线的建立
使用已知分子量的标准蛋白，在相同 条件下进行电泳，绘制迁移率与分是指凝胶能够区分相邻蛋白条带的能力，高分辨率的凝胶能够清晰区分 相近分子量的蛋白质。
电泳的原理
电场作用
01
在电场的作用下，带负电荷的SDS-蛋白质复合物向正极移动。
分离效果
02
不同分子量的蛋白质在电场中移动速度不同，从而实现分离。
检测方法
03
电泳结束后，可以通过染色、银染或荧光染色等方法检测分离
的蛋白质条带，并可根据染色深浅判断蛋白质含量。
02
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 的实验步骤
电泳
01
02
03
安装电极
将凝胶放置在电泳槽中， 确保电极与凝胶接触良好。
加样
将准备好的样品加入到凝 胶的样品孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳。确 保电流稳定，避免电流过 大或过小对实验结果的影 响。
染色和脱色
染色
在电泳结束后，将凝胶取出，放 入染色液中染色，使蛋白质条带 呈现可见的着色。
脱色
将染色后的凝胶放入脱色液中脱 色，去除背景颜色，使蛋白质条 带更加清晰可见。
分离度
分离度是指凝胶中各蛋白条带之间的分离程度，好的分离度能够使各蛋白条带 完全分开，便于准确分析。
实验误差和注意事项
实验误差来源
实验误差可能来源于电泳过程中电压、电流的波动、染色过程中染料的浓度和染 色时间等因素。
注意事项
为确保实验结果的准确性，应使用高质量的电泳试剂和设备，严格控制实验条件 ，并遵循标准化操作程序。同时，应定期对标准蛋白进行检测，以确保标准曲线 的准确性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
. 样作为实验组来 同上项目三 SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）测定蛋白质分子量一实训目的1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein ），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS 能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成 S DS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在 1.2X104～16.5X104 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW ＝K －bm(LogMW 为分子量的对数，K 、b 为常数，m 为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量 三、实训器材序号 1 2 3 4 56 设备名称垂直板电泳槽及附件 直流稳压稳流电泳仪 微量进样器玻璃注射器玻璃平板电炉 规格，型号可变压数量1 12 1 41序 试剂纯度、浓度 作用配 制 需要工具 需要工具号 方法1低分子量标 准蛋白质样 2mg /ml以标准样品为 对照即可确定 见 表 格 下 水浴锅、小烧 杯，玻璃棒 本样品各区带的 方成分210~20mg/ml水浴锅、小烧品3浓缩胶缓冲 液测定蛋白质的 分子量呈弱酸性，使甘 同上 氨酸解离很少， 在电场作用下， 涌动效率低，二 氯离子含量高，杯，玻璃棒天平、容量 瓶、棕色试剂 瓶保 证 电 泳 的 作为催化剂，产去掉其电荷效SDS加速剂，可催化4分离胶缓冲 液形成较高的电 位梯度压着蛋 白质聚集在一 起，凝缩为一狭 小区带。
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四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
•
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
三.
实验试剂和器材
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去
底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再 加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 （2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上 样量分别为5µl 和10µl。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
二.
实验原理
• 采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，
往往采取2 种以上测定方法结合使用。目前其他常用 测定相对分子量的方法有： • 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量 （有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适 宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需 2000 伏特小时） • 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单， 样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物 活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关 系比较好，但在极端 pH 时，蛋白质有可能因变性而 偏离。）
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的 SDS- 蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
.
11.实验结果分析。
五.分析计算
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的 相对迁移率作图得标准曲线，量出未 知蛋白的迁移率即可测出其分于量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的 样品的分子量测定才具有可靠性。
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml) H2O 30%Acr Buffer 10%SDS 10%Ap TEMED 2.6ml 1.7ml 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.05ml 0.05ml 5µ l
二.
• 1)
实验原理
2)
3)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完的目的是为了使分离胶上延平直，并排除 气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底 需水平.
四. 实验过程
二.
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只
•
•
有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能 定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线 性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理， 巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧 化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链 （如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用 下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时 只是它们的亚基或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE 测定分子量。如电 荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某 些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一.
实验目的
• 学习 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原
理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染 色鉴定。
二 .实验原理
• 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这
• •
种现象称为电泳。 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
浓缩胶(5%.3ml) 0.7ml 1.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 0.03ml 0.03ml 4µ l
四.
实验过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的 锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5 厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次 性完成,避免产生气泡.
六.思考题
• 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 当分离胶加完后 , 需
在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?