2010实验一二_重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法
质粒DNA的提取及电泳
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保 存备用。
4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
四． 操作步骤
点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3. 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 4. 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要 避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和 电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面 高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心 吸出，以免影响加样。
7. 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～
1. 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升）， 接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。
2. 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心 管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离
质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1. 学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA 的方法；2. 学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3. 学习并掌握紫外吸收检测DNA 浓度和纯度的原理和方法；4. 学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1. PCR（多聚酶链式反应）在DNA 聚合酶催化下，可以DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCF一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95C，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35-70C, —般低于模板Tm值的5C 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2. 质粒DNA 的提取与制备（1）. 碱裂解法：染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）.离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B. 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C. 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3. 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A280V1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
重组质粒DNA的提取、 酶切鉴定
1.0 ml
＋ 200l
悬浮液
细胞悬浮液（STE） 葡萄糖：提供等渗环境，增加溶液的粘度, 防止
DNA受机械作用而降解 Tris·HCl （三羟甲基氨甲烷） :
不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性 EDTA(乙二胺四乙酸二钠):
螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制DNase保 护DNA；EDTA的存在,有利于溶菌作用。
温放置5min；
(3)加入200l细菌裂解液，颠倒混匀，待溶液变粘稠后，
立即进行下一个步骤； (4)加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上 5min，
12,000转/分，离心 5min；
(5)将上清移至另一管中,加入等体积的TE饱和酚/氯仿
(1:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 2min；
离心 2min
＋等体积TE
饱和酚/氯仿
移上清时要定量，不要混入白色沉淀物或漂浮物
饱和酚/氯仿(1:1)
！！带手套，一旦沾染皮肤请立即用大量清水冲洗！ 酚：使蛋白质变性沉淀 变性效果好，但与水部分互溶。
氯仿：可使蛋白质变性沉淀 变性效果没有酚好，但与水不相混溶。
离心后分层
上层水相含质粒 水相下面是变性蛋白 下层酚/氯仿
冰上 5min后 12,000转/分
离心 5min
移上层水相
于另一管中
7
接提取质粒的操作流程及具体原理
（包括一些试剂的作用原理 ）
移上层水相
于另一管中
分层
＋等体积 氯仿/异戊醇
!!移上清时要定量，宁少勿多!
氯仿/异戊醇(24:1)溶液
氯仿：将残留在水相中的酚带走； 也可以再次使蛋白变性。
异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生；
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：201000100122 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
分子医学实验：实验四 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定1
Molecular medicine Skills
问题：
1.提取质粒DNA的目的？ 2.什么是限制性核酸内切酶？有何作用？ 3.为什么选用双酶切？
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时的三者泳动速度大小关系？
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Molecular medicine Skills
质粒DNA与宿主菌染色体DNA的区别：
宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA
要大得多
Escherichia coli. This organism was named for its discoverer, Theodore Escherich, and is one of the premier model organisms used in the study of bacterial genetics, physiology, and biochemistry. This enteric organism is typically present in the lower intestine of humans, where it is the dominant facultative anaerobe present, but it is only one minor constituent of the complete intestinal microflora. E. coli, is capable of causing various diseases in its host, especially when they acquire virulence traits. Strains of E. coli can cause urinary tract infections, neonatal meningitis, and many different intestinal diseases, usually by attaching to the host cell and introducing toxins that disrupt normal cellular processes. Virulence proteins may be encoded on extrachromosomal plasmids or within bacteriophages and distinct DNA segments termed pathogenicity islands (PAIs). PAIs are likely to have been transferred horizontally and may even have integrated into the chromosome through bacteriophage or plasmid
实验五-酶切鉴定-紫外分光光度检测DNA含量可编辑全文
二、制胶
步骤
注意事项
1.称量agarose和buffer
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的
瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引 起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
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产生误差的原因： 1.单色性不纯的影响； 2.杂散光的影响； 3.比色皿的影响； 4.温度、pH值的影响； 5.吸光度读数时的误差。
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2.4.2 实验步骤：
1. 0.1×TE 作 为 空 对 照 , 在 波 长 260nm 、 280nm 、 310nm处分别测标准DNA样品的OD值
2. 根据OD值计算DNA浓度（ g/ml）
二、紫外分光光度法检测DNA
2.1 分光光度技术
2.1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光
谱对其进行定性、定量分析的实验技术。
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2.1.2 特点
①灵敏度高：测定下限可达10－5～10－ 6mol/L
②准确度高：能够满足微量组分的测定要求， 相对误差2～5％ （1～2％）;
③操作简便快速; ④应用广泛。
用蒸馏水或溶剂作为“空白”校正反射光、 分散光，得： 入射光（I0）＝吸收光＋透过光（It）
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Lambert-Beer定律
D＝K C L
吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm）
溶液浓度（mol/L）
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2.2.3 分光光度法分析的依据： ①物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取
决于物质的结构，这就是分光光度法定性 分析的依据； ②其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这 是分光光度法定量分析的依据。
实验一二重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法
3‘
Hind
II355I '''--CA
T A
T G
A C
A T
G-
T-3' 3'-T T C
G A A-5'
PUC119 （3.2K b）
U6启动 子（25 6bp）
电泳检测
2.2 实验材料: (1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
31
2.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
μl上样缓冲液，混匀 ）
电泳（100V 0.5小时，5V/cm）
染色与检测
（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯 下检测）
一、电泳前准备
准备内容
作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer
、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DN
A
细菌的细胞壁破裂，内
3.1 实验原理： 容物释放
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双
高碱
链DNA；
② ①线质性粒双DN链A不DN发A片生段断中裂的，氢保键持断双裂链，闭双合 链 环解状离；变性。
DNA分子的有效分 0.8 0.5 0.4 0.2 0.1
2 实验材料及试剂
琼脂糖
电泳缓冲液：1TAE 10 加样缓冲液 EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，
在波长为254nm~365nm的紫 外光照射下呈橘红色（530n m）的荧光.
实验一 质粒DNA的提取纯化、限制性酶切及电泳检测
实验一 质粒DNA的提取纯化、限制性酶切及电泳检测内 容 提 要本实验采用碱裂解法提取细菌细胞中的质粒DNA，经酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀等步骤，从而得到适用于基因操作的质粒DNA。
采用分子生物学软件查找质粒DNA的酶切位点，然后利用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切反应，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统进行分析鉴定。
本实验要求：1．通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。
2．掌握质粒DNA的限制性内切酶酶切分析，了解内切酶的性质。
3．学习DNA的电泳检测。
原 理1．质粒DNA的提取把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
质粒(Plasmid)作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，广泛应用于基因操作的各个方面。
因此，质粒的分离与提取是分子生物学中最常用、最基本的实验技术。
质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1-200kb不等。
大多数来自细菌细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠(SDS) 破坏菌体细胞壁，并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。
提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。
鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。
根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。
同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。
通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳
4) 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
质粒量 缓冲液 EcoR1 Xho1
H2O 总体积
（ng） (μl)* （μl） （μl） (μl) （μl）
I 200
2
0
0 17-19 20
II 200
2
0.5
0 15-17 20
III 200
2
0.5 0.5 14-16 20
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。
置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分 别加入10l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15l进 行电泳分析。
2) 琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖， 置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE 工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该 三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3）胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶 条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一 水平位置模具上，放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小 心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速 度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整 个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10a 10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
质粒DNA的提取与酶切鉴定 (2)
四、碱裂解法小量制备质粒DNA
1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基 中，37℃震荡培养12～16小时；
2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液， 在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮
3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞， 尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程 中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与 二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解
2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链 DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段 的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特 性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类， Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及 依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识 别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内 切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限 制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。
质粒图谱:
五、 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳
1、在1.5mL Ep管中次加入下列溶液于1.5ml离心管中
提取质粒DNA
4.0 L
10× buffer H
1.0 l
EcoR I
1.0 l （2.0 U）
dd H2O
4.0 L
10 L
1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，
在20 L 反应液中反应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量.
质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
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一、实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法4、了解质粒酶切鉴定原理5、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小二、实验原理1、PCR：在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：（1）变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
（2）退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35~70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
（3）延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2、质粒DNA的提取：（1）碱裂解法：1）基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：2）高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；3）当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）离心层析柱：1）硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
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一.质粒DNA的提取
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
7
1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
28
PUC119 （3.2Kb）
BamHI
双酶切
Hind III 重组质粒
BamHI 5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III 5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'
μl上样缓冲液，混匀 ）
电泳（100V 0.5小时，5V/cm）
染色与检测
（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯下检测）
一、电泳前准备
准备内容 作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 3.根据DNA的分离范围选择合适的 胶浓度并记录
防止不必要的重复污染，减少外来 的污染。梳子干净有利于梳孔的 形成。
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
1.1 定义
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子 的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
U6启动子 （256bp）
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
32
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
35
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
25
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE
10 加样缓冲液
EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，在波长为
254nm~365nm的紫外光照射下呈橘 红色（530nm）的荧光.
3 实验步骤
琼脂糖凝胶板的制备
（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
排除电泳槽的电极接触不良，确保 buffer的缓冲能力，减少污染。 达到较好的分离效果，防止样过快 跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的 实验记录备查 用量记录，胶最终越薄越好。
二、制胶
注意事项 步骤 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确
3.3 除去上清，加入冰的200 µ 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min l 实 加入200µ 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min l 验 步 加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 骤
转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min， 12000g×5min
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
注意事项：
1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！
8
1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
9
(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
10
(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的 瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引 起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右， 即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧， 缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定 的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头 赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显； 不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。 过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
13
1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的。
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
4.室温凝胶30分钟
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
注意事项 步骤 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样 1 X，混匀 品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高， 电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰 坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起 时不要过猛带出样品。每点一个样完， 吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果 是有特殊要求，例如回收，强烈建议每 点一个样换一次枪头。加样的速度当然 是越快越好，注意保证质量。点样的量 不要太大，一方面是体积不要太大，溢 出污染邻位样品；一方面两不要太大， 容易导致脱尾和模糊不清。 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。 跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出 胶等意外发生。
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）