胶体金生产工艺配方原则参考幻灯片
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胶体金生产工艺配方原则
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尿液类样品垫 注意交叉反应的消除。
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影响抗原抗体反应的外部因素
电解质
抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为 疏水胶体的过程中须有电解质参与才能进 一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水 化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大 块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不 出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物 的形成，常用O.85％氯化钠或各种缓冲液 作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解 质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。
解决方法：检查标记过程，BSA封闭
57
惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
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缓冲液的基本成分
各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等
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蛋白结合到固相材料上
蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 取决于
蛋白溶液扩散到固相表面 蛋白从溶液中分离出来 蛋白吸附到固相上 蛋白重排到最低能态
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吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
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作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性, 提高稳定性
定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越
强”
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缓冲液的优化
离子强度
对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度， 蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度， 溶液配制中就已会出现沉淀。
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PPT78页)
245 185 140 100
胶体金诊断试剂工艺配方原则
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
不同种类膜的 IgG结合能力
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
不同种类膜的 BSA结合能力
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
胶体金诊断试剂工艺配方原则
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
不同种类膜的 IgG结合能力
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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不同种类膜的 BSA结合能力
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
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胶体金诊断试剂工艺配方原则概述(PP T78页)
❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
胶体金生产工艺配方原则参考幻灯片共81页
胶体金生产工艺配方原则参考幻灯片
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢
胶体金技术简介 ppt课件
稳定性好：金标试剂稳定，可长期室温保存
检测标本种类多：既可用于测血清/血浆/全血，又可用于测 尿或唾液,或处理后的组织等固体样品
6
免疫层析法应用领域
类别 人类医学
农牧业 环境 食品安全
应用领域
检测的物质
各级医院,血站,CDC,防 疫站,诊断中心；家庭
自检；商检系统；边检 口岸；公安系统.
女性妊娠（hCG,LH等)
传染病（乙肝五项、艾滋,、梅毒、流感等） 肿瘤标志物（AFP、、粪便血红蛋白等）
心梗系列(肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶）
毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒等）
畜牧兽医站, 商检系统, 传染病（禽流感、兽瘟疫等）
边检口岸,农牧类院系
和研究所
病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）
环保监测部门,研究机 有害物质超标 构
喷点法与浸泡法的比较 (AJQ3000喷头)
1.释放快慢 2.液体量不同，干燥快慢，边缘
效应 3.生产方便性
20
样品垫
材料选择
各成分的作用 1.缓冲溶液的作用 (PH) 2.盐的作用 3.大分子蛋白BSA\PVP 4.表面活性剂 Tween-20,TritonX-100
21
吸水纸
吸水效率 进口与国产纸的差异
一步法
固相系统,常温保存
开发周期长,使用方便
20-40nm 胶体金 大孔径膜 侧向流动
免疫渗滤法
多步法
液体/固相系统 液体需要冷冻保存 开发周期短,使用不方便
10-15nm 胶体金 小孔径膜 竖向流动
4
免疫层析法技术优势:简单/现场/快速
1.打开包装取出试纸条 2.直接插入待测样品中 3. 目测读出结果（3-10分钟内）
胶体金 ppt课件
(三) 技术要点
• 1.试剂盒组成 ①滴金反应板 (图20-1)胶体 金免疫渗滤试验中主要试剂成分之一， 由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或 抗体的醋酸纤维素膜片三部分组成。② 胶体金标记物 ③洗涤液 。
2.操作要点
• 2.操作要点 ①将反应板平放于实验台面上，于 小孔内滴加含待测抗原标本1-2滴，待完全渗 入；②于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂1-2 滴，待完全渗入；
• （2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一
种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小 不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～ 20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒 红色，20～40nm之间吸收波长530nm， 液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收 波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心
去掉较大的金颗胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金 却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以 检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程 度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶 体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。 当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的 粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些 代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体 金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的， 若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示 此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。
最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。
①先配制HAuC14水溶液，加热至沸。②搅动下准 确加入一定量的柠檬酸三钠 （Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。③继续加热煮 沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶 液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色， 随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。④冷 却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。通过改变柠 檬酸三钠的用量可以制得不同大小的胶体金颗粒
胶体金技术简介 ppt课件
80年代：第一代产品，免疫渗滤法 (Flow Through)
90年代：第二代产品，免疫层析法 （Lateral Flow）,女性妊娠 HCG
21世纪：快速诊断方法适应市场需要， 胶体金技术进入快速发展期，成为IVD 的热点（传染病、毒品、食品安全、畜 牧兽医等领域）
3
两种技术的比较
免疫层析法
胶体金技术简介
BioDot中国
胶体金技术的起源
1971年,Faulk 和Taytor在做免疫金电镜 实验时引入
胶体金：是一种分散相颗粒在1～ 100nm之间的分散体系，外观透明不浑 浊，在普通显微镜下看不见；颜色为红 色,指示剂
胶体金复合物（conjugate）:与抗体连接
2
胶体金技术的发展
（以小分子吗啡检测为例）
11
免疫层析法检测原理分类介绍 （间接法，标记proteinA）
（以HIV抗体检测为例）
12
免疫层析法检测原理分类介绍 （双抗原夹心法，标记抗原）
同上，测抗体
13
技术流程
Materials Reagents Processes
Sample Pad
Conjugate Pad
25
注意事项
试剂原料耗材的批号控制，确保来源可靠有保障 设置关键控制点，确保流程无差错 仪器定期维护校准 研发时即考虑一定生产量的工艺问题，避免上量后不匹配 均一性，稳定性
26
胶体金技术在中国的发展---回顾
1995年：国内基本空白，没有研发，1-2家生产单位仅是大包装分切 1997年：杭州艾康起步，依靠美国技术转让快速发展为国内第一品牌，
22
粘性底板
原理作用 供应商的选择 对NC膜的影响
23
干燥方法
90年代：第二代产品，免疫层析法 （Lateral Flow）,女性妊娠 HCG
21世纪：快速诊断方法适应市场需要， 胶体金技术进入快速发展期，成为IVD 的热点（传染病、毒品、食品安全、畜 牧兽医等领域）
3
两种技术的比较
免疫层析法
胶体金技术简介
BioDot中国
胶体金技术的起源
1971年,Faulk 和Taytor在做免疫金电镜 实验时引入
胶体金：是一种分散相颗粒在1～ 100nm之间的分散体系，外观透明不浑 浊，在普通显微镜下看不见；颜色为红 色,指示剂
胶体金复合物（conjugate）:与抗体连接
2
胶体金技术的发展
（以小分子吗啡检测为例）
11
免疫层析法检测原理分类介绍 （间接法，标记proteinA）
（以HIV抗体检测为例）
12
免疫层析法检测原理分类介绍 （双抗原夹心法，标记抗原）
同上，测抗体
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技术流程
Materials Reagents Processes
Sample Pad
Conjugate Pad
25
注意事项
试剂原料耗材的批号控制，确保来源可靠有保障 设置关键控制点，确保流程无差错 仪器定期维护校准 研发时即考虑一定生产量的工艺问题，避免上量后不匹配 均一性，稳定性
26
胶体金技术在中国的发展---回顾
1995年：国内基本空白，没有研发，1-2家生产单位仅是大包装分切 1997年：杭州艾康起步，依靠美国技术转让快速发展为国内第一品牌，
22
粘性底板
原理作用 供应商的选择 对NC膜的影响
23
干燥方法
胶体金介绍ppt课件-PPT课件
评价指标
灵敏度：试剂具有检测出最低量被检物的能力。 灵敏度是诊断试剂的首要质量指标。 特异性：试剂正确检定不存在的被检物质的能力（即 无假阳性）。 精密度：重复测定值之间的符合程度，批内CV（变 异系数）值应小于15%。 稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间。
发展方向
形式创新
显示窗口的设计、显示结果显示设计
吸水棒吸水后会改变颜色
技术创新
Technology 技术
项目开发技术路线图
抗体的制备 抗体膜的制备 装配
固相膜筛选
胶体金标记 技术的研究
胶体金的制备 胶体金标记物的制备 胶体金标记物吸附在玻纤上
固相技术 的选择优化
试纸板的生产 切割
组装、包装
膜的介绍
1、硝酸纤维素膜 在检测线和对照线条带区域固 定抗体 2、包被材料 将抗原或抗体通过喷膜机喷到 硝酸纤维膜上的过程叫包被过程。
3、喷膜机 喷膜机是将包被液包被到膜上 面的机器。 影响产品质量和实验效果的参 数有： ①喷膜速度 ②喷膜参数 ③灌注量 ④线条间隔和位置
金子垫的介绍
1、标记材料 将胶体金和标记材料结 合起来的过程叫标记。 标记材料的作用是和胶 体金标记物结合，捕获目 标蛋白，结合膜上T线材 料，从而显示出检测结果。
试纸条组成结构
胶体金垫 样品垫 控制线（C线） 吸水滤纸
PVC底板
层析方向 测试线 （T线）
NC膜（硝酸纤维素膜）
胶体金层析法一般原理介绍
（双抗体夹心）
（以HCG检测为例）
视频
早早孕产品形式
图片
形式
试纸条
卡型
笔型
电子验孕笔价格源自最经济3-5元5-10元
>$5.0
胶体金组研发思路PPT课件
检测方法-胶体金法
2
1 不同环境下的稳定性好、易保存、运输，在室温下可长期保存，不
需冷藏。
2 操作简便、易于肉眼观察结果，不需经过特殊复杂培训，操作者安
全，对环境无污染。
3 操作快速、短时间获得检测结果，一般10—15 分钟即可得出结论，
便于大批量筛查，取量少，检测成本均较低，无需特殊仪器。
4 适用范围广泛，检测标本种类多，可用于查血、尿液或粪便，因而
标金过程
4
胶体金的标记
复溶 离心
PH 蛋白ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
调试
封闭液
pH：在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时,胶体金蛋
白质的吸附力最强;pH过高过低都不利于两者的结合, 因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条, 采用不同方法重复校正,并进行梯度试验找到最佳的 标记pH。
蛋白：过多蛋白质标记,造成浪费的同时引起试纸
适合各种检查。特异性较强、结果有可重复性。
胶体金的制备
3
胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每 次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度 及有无凝集颗粒等。
要还原材料：氯 金酸（HAuCl4）
所用还原剂： 柠檬酸钠
还原制备金溶胶
采用化学还原法制备胶体金时， 通过改变反应体 系中氯金酸与还原剂的比例（增加或减少还原剂 的量） 可得到所需不同直径的金颗粒。
胶体金组研发思路
目录
●明确对象 ●检测方法-胶体金法 ●胶体金的制备 ●标金过程 ●试纸条的组成 ●性能评估 ●投入市场
明确对象
1
猪瘟
犬细小 犬瘟
猪瘟
• 猪瘟病毒是猪瘟的病原,主要通过直接接触，或由于接触 污染的媒介物而发病。
胶体金试纸条的制备 ppt课件
颗粒； • ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒； • ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
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推荐的起始缓冲液
❖10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol
20
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“潜水艇” 效应
❖表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问 题
❖因为使用的表面活性剂是水溶性的 ❖喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了
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❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
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缓冲液的基本成分
各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等
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❖蛋白质疏水性状和亲水性状
当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常 稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开 在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水 分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白 质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团 收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的 固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水 基团通过疏水作用力结合，达到固定的目 的。
5
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孔径对侧向层析速度的影响
标称孔径 (m)
3 5 8 12
层析 4.5 cm 的时间 (sec)
245 185 140 100
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不同种类膜的 IgG结合能力
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不同种类膜的 BSA结合能力
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反应动力学
❖流速增加,反应速率减低 ❖流速增加,检测时间缩短 ❖流速增加,灵敏度降低 ❖流速增加,试剂用量增加 ❖流速增加,背景降低 ❖距离增加,流速降低 ❖孔径增加,蛋白结合量减少
22
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二、和金子垫相关的配方和原理
❖和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液
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蛋白结合到固相材料上
❖ 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 ❖ 取决于
▪ 蛋白溶液扩散到固相表面 ▪ 蛋白从溶液中分离出来 ▪ 蛋白吸附到固相上 ▪ 蛋白重排到最低能态
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吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
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多位点结合
只有1个位点的结合是可逆的
多位点结合使得蛋白稳定在固相表面， 即使其中的每个单位点都是可逆的
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影响蛋白结合的因素
▪ 蛋白缓冲液 ▪ 使用的膜 ▪ 蛋白自身 ▪ 应用体系
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蛋白缓冲液
❖没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别 优化。
❖作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性, 提高稳定性
❖定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越
强”
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缓冲液的优化
❖ 离子强度
▪ 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度， 蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度， 溶液配制中就已会出现沉淀。
❖ pH
▪ 蛋白在等电点最不稳定
❖ 沉淀剂
▪ 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带 有的静电，利于结合包被。
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
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❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
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❖静电作用力
静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用 力
❖疏水作用力
疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏 水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对 维持分子的三、四级结构起着重要的作用。 每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。
蛋白标记原理
❖蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依 靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固 地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分 子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个 蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互 接触，使该胶联溶液较为稳定。
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要点
❖蛋白的预处理
❖使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚 集
❖合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）
❖搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速 度
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盐滴定
❖盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 ❖盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可
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胶体金颗粒的形成
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胶体金的生产
❖2种重要步骤
▪ 直接形成 ▪ 分步形成
❖大多数人用分步形成
▪ 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 ▪ 能够生产出大颗粒胶体金
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颗粒大小对胶体的影响
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胶体金诊断试剂工艺 配方原则
内容
一、和膜相关的配方和原理 二、和金子垫相关的配方和原理 三、和样品垫相关的配方和原理 四、相关问题
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一、和膜相关的配方和原理
电镜下的NC膜
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硝酸纤维膜生产工艺图
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孔径 HLJ
标记工艺
❖胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶
胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，
为负电荷分布。
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高质量结合物
❖单个分散的颗粒 ❖圆形颗粒 ❖很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好
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Cluster free, high quality gold reagent
Clustered, poor quality gold reagent Made by：QS HLJ
胶体金的生产
❖胶体金的形成是还原HAuCl4.
❖HAuCL4 + e-
Au0
❖还原剂越强，得到的金颗粒越小
❖生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠