胶体金生产工艺配方原则参考幻灯片

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孔径对侧向层析速度的影响
标称孔径 (m)
3 5 8 12
层析 4.5 cm 的时间 (sec)
245 185 140 100
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不同种类膜的 IgG结合能力
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不同种类膜的 BSA结合能力
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为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
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❖静电作用力
静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用 力
❖疏水作用力
疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏 水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对 维持分子的三、四级结构起着重要的作用。 每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。
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胶体金颗粒的形成
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胶体金的生产
❖2种重要步骤
▪ 直接形成 ▪ 分步形成
❖大多数人用分步形成
▪ 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 ▪ 能够生产出大颗粒胶体金
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颗粒大小对胶体的影响
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❖作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性, 提高稳定性
❖定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越
强”
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缓冲液的优化
❖ 离子强度
▪ 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度， 蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度， 溶液配制中就已会出现沉淀。
胶体金诊断试剂工艺 配方原则
内容
一、和膜相关的配方和原理 二、和金子垫相关的配方和原理 三、和样品垫相关的配方和原理 四、相关问题
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一、和膜相关的配方和原理
电镜下的NC膜
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硝酸纤维膜生产工艺图
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孔径定义的问题
蛋白标记原理
❖蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依 靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固 地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分 子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个 蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互 接触，使该胶联溶液较为稳定。
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要点
❖蛋白的预处理
❖使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚 集
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❖蛋白质疏水性状和亲水性状
当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常 稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开 在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水 分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白 质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团 收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的 固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水 基团通过疏水作用力结合，达到固定的目 的。
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蛋白结合到固相材料上
❖ 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 ❖ 取决于
▪ 蛋白溶液扩散到固相表面 ▪ 蛋白从溶液中分离出来 ▪ 蛋白吸附到固相上 ▪ 蛋白重排到最低能态
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吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
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标记工艺
❖胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶
胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，
为负电荷分布。
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高质量结合物
❖单个分散的颗粒 ❖圆形颗粒 ❖很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好
反应动力学
❖流速增加,反应速率减低 ❖流速增加,检测时间缩短 ❖流速增加,灵敏度降低 ❖流速增加,试剂用量增加 ❖流速增加,背景降低 ❖距离增加,流速降低 ❖孔径增加,蛋白结合量减少
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二、和金子垫相关的配方和原理
❖和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液
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Cluster free, high quality gold reagent
Clustered, poor quality gold reagent Made by：QS HLJ
胶体金的生产
❖胶体金的形成是还原HAuCl4.
❖HAuCL4 + e-
Au0
❖还原剂越强，得到的金颗粒越小
❖生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠
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多位点结合
只有1个位点的结合是可逆的
多位点结合使得蛋白稳定在固相表面， 即使其中的每个单位点都是可逆的
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影响蛋白结合的因素
▪ 蛋白缓冲液 ▪ 使用的膜 ▪ 蛋白自身 ▪ 应用体系
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蛋白缓冲液
❖没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别 优化。
❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
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缓冲液的基本成分
各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等
❖ pH
▪ 蛋白在等电点最不稳定
❖ 沉淀剂
▪ 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带 有的静电，利于结合包被。
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
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❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
❖合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）
❖搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速 度
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盐滴定
❖盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 ❖盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可
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推荐的起始缓冲液
❖10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol
Βιβλιοθήκη Baidu20
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“潜水艇” 效应
❖表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问 题
❖因为使用的表面活性剂是水溶性的 ❖喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了
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