芯片数据预处理方法-

寡聚核苷酸芯片原始数据，并使用exprs函数()查看表达值。
了解芯片预处理的原理和步骤后，完全可以用一个R函数完成数据 处理得到表达值，如Affy包提供的处理函数expresso( )。
最近的k个临近基因的表达值来预测待填补基因的表达值。根据邻居基因在样本中的
加权平均估计缺失值。
2.3 提取表达值
由于芯片数据的小样本和大变量的特点，导致数据分布呈偏态、标准差大。 对数转换能使上调、下调的基因连续分布在0的周围，更加符合正态分布，同时 对数转换使荧光信号强度的标准差减少，利于进一步的数据分析。 cDNA芯片：对双通道数据使用Cy5（红）和Cys3（绿）两种荧光标记分别标记 case和control样本的cDNA序列。扫描仪采用两种波长对基因芯片的图像进行扫 描，根据每个点的光密度值计算相对应的绝对表达量(intensity)；然后图像分 析软件通过芯片的背景噪音以及杂交点的光密度分析，对每个点的intensity校 准，利用Cy5/Cy3的值获取case与control组不同基因的表达值ratio（（R/G
另一种常用基因芯片——寡核苷酸表达谱芯片的数据预处理：由于探针长度 较短（20-25bp），采用匹配/失配探针对方法，即设计一个特异的寡核苷酸（ PM 匹配）、同时设计一个非特异性的寡核苷酸探针（ MM失配），该探针仅仅在中 间位置有一个碱基替换。用PM与MM之间的差值作为信号强度，来解决寡核苷酸 之间非特异性杂交的噪声影响。一般设计11-20对探针来检测一个转录本。 寡核苷酸芯片与cDNA芯片的数据预处理差别主要集中在转录表达值的获取， 即如何将11-20对探针值转化为单个转录的表达值呢，常用三种预处理方法，即 MAS、RAM法、MBEI法。MAS方法将芯片分为k（默认值为16）个网格区域，用 每个区域使用信号强度最低的2%探针去计算背景值和噪声。R M A , 该方法使用回 旋( convolution) 模型计算出芯片的非特异杂交背景均值, 然后以 P M 值减去该均值 获得校正的 P M 值, 再以对数相加模型计算转录的表达值。 使用软件提取表达值：R的affy包ReadAffy()函数可以读取Affy公司出的CEL格式
比率统计法
此方法用于标准化同一块芯片上杂交的两种样品，并且建立于以下的假设之上：在近
似的两个样品中，虽然基因有上调和下调，但一些基本的基因（如管家基因）的表达量是 近似相同的。由此得出一个近似概率密度公式：比率T =R /G（R 和G分别是芯片上第K个点 的红光和绿光的强度），经过迭代算法处理得到一个平均表达比率及其可信限，用于数据
先定义个阈值M。若行（列）向量中的缺失数据量达到阈值M，则删去该向量。若未
达到M，有两种方法处理，一是以0或者用基因表达谱中的平均值或中值代替，另一 个是分析基因表达谱的模式，从中得到相邻数据点之间的关系，据此利用相邻数据点 估算得到缺失值（类似于插值）。填补缺失值（ k临近法）：利用与待补缺基因距离
ratio）；一般选择以2为底的对数转化数据，比如R/G=1，则 log2R/G=0，即认
为表达量没有发生变化，当R/G=2 或者，R/G=0.5，则log值为1 或–1，这是可 以认为表达量都发生两倍的变化。 以下的数据处理都是对log2R/G的形式进行分析。
2.4 归一化
经过背景处理和数据清洗处理后的修正值反映了基因表达的水平。然而在芯片试验中， 各个芯片的绝对光密度值是不一样的，在比较各个试验结果之前必需将其归一化 （normalization，也称作标准化）。 数据的归一化目的是调整由于基因芯片技术引起的误差，不是调整生物RNA 样本的差异。 在同一块芯片上杂交的、由不同荧光分子标记的两个样品间的数据，也需归一化。常用的 标准化方法有“看家基因法”、基于总光密度的方法、回归方法、比率统计法等。
的标准化计算。
常用的方法是平均数、中位数标准化(mean or median normalization)： 将各组实验的数据的log ratio 中位数或平均数调整在同一水平。中位数标 准化：将每个芯片上的数值减去各自芯片上log Ratio值的中位数，使得 所有芯片的log Ratio值中位数就变成了0，从而不同芯片间logRaito具有可
基因芯片探针水平数据处理的R软件包有affy, affyPLM, affycomp, gcrma等。
2 预处理 2.1 背景（background）处理
背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。一 般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的
平均值作为背景，但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点。也
基因芯片的实验流程（双通道）
单通道/双通道基因芯片实例
基因芯片数据分析：对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取 的杂交点荧光信号进行定量分析，通过有效数据筛选和相关基因 表达谱聚类，发现基因的表达谱和功能之间的联系。
杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫 描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。
比性。
3 差异基因表达分析
经过预处理，探针水平数据转变为基因表达数据。为了便于应用一些统计和 数学术语，基因表达数据仍采用矩阵形式。 倍数分析方法：倍数变换fold change，单纯的case与control组表达值相比较， 对没有重复实验样本的芯片数据，或者双通道数据采用这种方法（该方法是对基 因芯片的ratio值从大到小排序，即cy5/cy3比值，一般0.5-2.0之间内的基因不存在 差异表达，范围之外存在差异表达。缺点是倍数选取具有任意性，可能不恰当） 参数法分析（t检验）：当t超过根据可信度选择的标准时, 比较的两样本被认 为存在着差异。但小样本基因芯片实验会导致不可信的变异估计，此时采用调节 性T检验 。 非参数分析：由于微阵列数据存在“噪声”干扰而且不满足正态分布假设， 用t检验有风险。非参数检验并不要求数据满足特殊分布的假设，所以可使用非 参数方法对变量进行筛选。如经验贝叶斯法、芯片显著性分析SAM法。
可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或 综合整个芯片非杂交点背景所得的平均吸光值做为背景。
背景处理之后，我们可以将芯片数据放入一个矩阵中：
m11 M = m21 mG1
m12 m22 mG 2
m1N m2 N mGN
其中，各字母的意义如下： N：条件数； G：基因数目（一般情况下，G>>N）； 行向量mi=(mi1,mi2,…,miN)表示基因i在N个条件下的表达水平（这里 指绝对表达水平，亦即荧光强度值）； 列向量mj=(m1j,m2j,…,mGj)表示在第j个条件下各基因的表达水平 （即一张芯片的数据）； 元素mij表示第基因i在第j个条件下（绝对）基因表达数据。m可以 是R（红色，Cy5，代表样品组）。也可以是G（绿色，Cy3,代表对照 组）。
常用的利用R的limma包使用t检验筛选差异表达基因， 利用R的siggenes包使用SAM方法筛选差异表达基因。
False Discovery Rate (FDR)
在基因芯片的实验中，每一个基因/探针，都是一个独立的实验。基因芯 片：高通量，>1,000个基因/探针。 因此，无论怎么比较，总会有一些基因 会是统计显著性差异表的 —— 可能是随机产生的。 如何评估表达差异基因预测的有效性？ FDR = p-value * No. of Genes 例：1,000个探针的双通道芯片，以p-value < 0.01为域值，发现7个上调基 因，5个下调基因，分析结果是否具有统计学意义？计算： FDR= 0.01* 1,000=10 (随机) 。7个上调基因，5个下调基因 < 10，因此上例计算的结果无 统计学意义。 FDR必须远小于发现的差异表达基因数目。
探针 荧光值
基因 表达值
计算机“读片”机理
将样品中的DNA/RNA标上荧光标记，则可 以定量检验基因的表达水平。
cDNA芯片、载有较长片段的寡核苷酸芯片采用双色荧光系统：目前常用 Cy3一dUTP（绿色）标记对照组mRNA，Cy5一dUTP（红色）标记样品组 mRNA
用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计 算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值，同 时计算机还给出直观的显色图。 在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的 基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色， 这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况。
2.2 数据清洗（data cleaning）
经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，还有一些单个异常大（或小）的 峰（谷）信号（随机噪声）。对于负值和噪声信号，通常的处理方法就是将其去除， 常见数据经验型舍弃方法有：标准值或奇异值舍弃法；变异系数法；前景值＜200； 前景值-平均数/前景值-中位数＜80%等等。然而，数据的缺失对后续的统计分析（尤 其是层式聚类和主成分分析）有致命的影响。Affy公司的芯片分析系统会直接将负值 修正为一个固定值。 对数据的删除，通常是删去所在的列向量或行向量。一个比较常用的做法是，事
基因芯片数据预处理
基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是 由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基 本原理是通过碱基互补配对检测生物信息。
4个技 术环节
基因芯片制备 样品制备mRNA提取等 杂交反应 信号检测与分析
分类
实验要求：单通道—— 一张芯片检验一种状态 ； 双通道——差异表达基 因的筛选 储存的生物信息：寡核 苷酸芯片（常为单通 道）、cDNA芯片（常为 双通道）
数据预处理分析流程：算法 （以cDNA芯片为例）
探针水平数据获得（计算机扫描图像）
数据预处理：背景处理、数据清洗、提取表达值、标准化、汇总
获取基因表达数据：判断差异基因表达
聚类和分析
1 探针水平数据（probe-level data）的获得