《生物化学》实验讲义

实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的意义1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。

2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。

二、实验原理 1、双缩脲反应当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。

双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。

借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。

2、茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。

含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。

该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。

因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。

3、黄色反应含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。

三、仪器与试剂 1、试剂(1) 蛋白质溶液：取10mL 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL ，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。

(2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。

(3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g 茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。

(4) 10％NaOH 溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。

2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。

四、操作方法 1、双缩脲反应(1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。

此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。

待试管冷却，加入约1mL10％NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。

混匀后观察出现的粉红色。

(2) 另取1支试管，加入1mL 蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH 溶液摇匀，然后再加入2滴1％的硫酸铜溶液。

摇匀观察其颜色变化。

(3) 注意事项加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。

(4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。

2、茚三酮反应(1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL ，再加OH +HNO 3HONO 2+H 2OHONO 2+ONOHOH0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。

(2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。

(3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。

3、黄色反应向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。

实验二蛋白质的沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出（浑浊现象），此现象叫蛋白质的沉淀反应。

（一）蛋白质的盐析作用一、目的意义了解盐析法及可逆沉淀的原理，学习用盐析法沉淀分离蛋白质。

二、实验原理盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。

盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。

盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐。

蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。

三、仪器与试剂1、试剂⑴蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。

⑵饱和硫酸铵溶液；⑶10%氢氧化钠溶液；⑷1%硫酸铜溶液。

四、操作方法1、取蛋白质溶液约2mL于试管中，加入过量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置3分钟则析出沉淀。

（二）重金属盐类沉淀蛋白质一、目的意义了解重金属盐类沉淀法的原理，学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。

二、实验原理溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。

重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。

但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解，此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。

三、仪器与试剂1、试剂⑴蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；⑵5% CuSO4溶液；⑶3%AgNO3溶液。

四、操作方法1、取试管2支各加蛋白质溶液1mL。

2、向各管分别滴加2－3滴加5％CuSO4溶液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。

3、在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入5％CuSO4溶液，观察沉淀的溶解。

（三）有机酸沉淀蛋白质一、目的意义了解有机酸沉淀法的原理，学习用有机酸沉淀法沉淀分离蛋白质。

二、实验原理生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。

凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。

如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。

当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成不溶性盐而沉淀。

溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛地被用于沉淀蛋白质，为首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。

三、仪器与试剂1、试剂⑴蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；⑵5%三氯醋酸溶液；⑶5% 单宁酸溶液。

四、操作方法1、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。

2、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴单宁酸溶液，观察现象。

实验三氨基酸的纸层析一、目的意义1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

2、学习纸层析的操作技术，分离鉴定未知样品的氨基酸成分。

二、实验原理纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。

滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。

将样品在滤纸上（此点称为原点），用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。

由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值Rf来表示的在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某物质的Rf值是一个常数，借此可作定性分析依据。

三、仪器与试剂1、试剂(1) 氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、脯氨酸。

(2) 混合氨基酸溶液：将1%的甘氨酸、脯氨酸也按1%浓度制成混合溶液。

(3) 展层剂：将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层后备用。

(4) 显色剂：0.1%茚三酮－正丁醇溶液。

2、仪器层析缸（12*12CM规格，垂直型）、层析滤纸（新华一号滤纸，事先裁成11*11CM规格）、电吹风（学生自带，每组一个）、三角板、铅笔和干纸巾（学生自带，每组一套）、毛细管。

四、操作方法1、准备滤纸：三个点，每隔2CM画一个“+”，用铅笔连起描成一条直线。

每个“+”点距离滤纸底端2CM。

2、点样：每个样品用毛细管点3次，每次点完后用电吹风吹干。

一个样品用一支毛细管。

3、饱和平衡：在缸底部玻璃突起的一侧加入10-15ml展层剂，另一侧先不加；让滤纸都放先放到未加展层剂的干燥一侧，然后盖上盖子平衡饱和20分钟。

（可写试验报告，简单讲课）4、开始层析：稍微拿出滤纸，再在干燥的一侧也加入10-15ml展层剂，然后让滤纸分别在该侧开始层析。

5、结束层析：等到展层剂上升到距离滤纸上端3cm左右，就拿出滤纸，用铅笔划线描出液体的上边界，然后用电吹风吹干。

6、茚三酮显色：把滤纸放在桌面上，整张纸用滴管滴加满茚三酮溶液，再用热风吹干，直到有结果出现。

7、计算RF值：用铅笔描出每个氨基酸的区域，测量距离计算甘氨酸和脯氨酸的Rf值。

（每个组需将该滤纸夹在组长的实验报告中，并注明是第几组）五、结果计算1、用铅笔将层析结果轮廓和中心点描出来，计算各种氨基酸的Rf值。

2、分析混合样品中未知氨基酸的组分。

六、作业题1、若展开剂高于点样线，对最终的层析结果有何影响？2、点样时，样品浓度太高或斑点之间间距过小，对最终的层析结果有何影响？实验四牛奶中酪蛋白的制备一、目的意义1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。

二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100mL。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、仪器与试剂1、试剂(1) 95%乙醇；(2) 无水乙醚；(3) 0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液：先配A液与B液，A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL；B液：0.2mol/L醋酸溶液，称纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL；取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。

(4) 乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）。

(5) 10%醋酸溶液2、仪器：新鲜牛奶；台式离心机、抽滤装置、精密pH试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、50ml大离心管。

四、操作方法 1、酪蛋白的粗提20mL 牛奶加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃（实验前水浴锅提前预热到43℃）、pH4.7的醋酸缓冲液20mL ，对照精密pH 试纸用10%醋酸溶液调pH 至4.7（肉眼可见絮状物质如果牛奶与缓冲液混合后，絮状沉淀出现不充分，需要加入较多的醋酸溶液，否则离心后没有分层）。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心10分钟（3000r/min ）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、酪蛋白的纯化(1) 加入40ml 蒸馏水搅拌洗涤沉淀，直接抽滤（事先检查真空泵是否已加满水）。

(2) 在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤（注意不要沾壁）。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀1次（不要更换滤纸），最后用乙醚洗沉淀1次，抽干。

(3) 将沉淀摊开在干燥滤纸上，电炉上烘干，得酪蛋白纯品。

(4) 准确称重，计算含量和得率。

五、结果计算X ＝100mV式中：X ──酪蛋白含量，g/100 mL 牛乳；V ──量取牛奶的体积，mL ； m ──收获酪蛋白的质量，g 。