基因探针-分子杂交技术(汇总).ppt
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生物化学课件 第四章 核酸杂交
单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
杂交技术 PPT课件
12
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
13
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
18
尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
19
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
21
c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
13
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
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尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
19
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
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c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。
同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
《分子杂交技术》PPT课件 (2)
优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要预
激活；易于操作
缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）
2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂 主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同 位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
分子杂交技术
分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物 分子的一门技术。
分
备样
子
品 泳电 膜转
杂
交
制
原
理
及
流
交杂
示结 果 显
程
探针制备
图
精选课件ppt
1
一. 分子杂交种类
1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体
2）蛋白质的免疫分析
制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封 闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色 反应（EIA）
或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）
精选课件ppt
5
三、 杂交样品膜的制备
1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）
激活；易于操作
缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）
2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂 主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同 位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
分子杂交技术
分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物 分子的一门技术。
分
备样
子
品 泳电 膜转
杂
交
制
原
理
及
流
交杂
示结 果 显
程
探针制备
图
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1
一. 分子杂交种类
1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体
2）蛋白质的免疫分析
制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封 闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色 反应（EIA）
或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）
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三、 杂交样品膜的制备
1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）
核酸分子杂交及芯片技术(共68张PPT)
〔二〕标记法
•酶反响法 将标记物〔放射或非放射〕预先标记在核
苷酸分子上，然后通过酶促反响将标记的核 苷酸分子渗入探针分子中。
•化学反响法 利用标记物(非放射为主)分子上的活性基团
与核酸分子上的基团发生化学反响而将标记物 结合到探针分子上。
1、随机引物法〔random priming〕 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新
Vacuum blotting 30~60分钟
–more efficient and quantitative than capillary –must apply vacuum evenly and not too strongly
3．印迹类型
• Southern印迹杂交
• Northern印迹杂交 • 斑点及狭缝印迹杂交
1、利随用机D引N物A聚法用合〔酶ra特来nd合o异m成p与性ri模mi板n的g互〕补细的菌新的、DNA病链。毒的核酸作为探针对组织细胞进
行杂交，确定有无该病原体的感染。
FISH(荧光原位杂交)结果
地高辛标记的探针用抗地高辛-罗丹明显示(红色)
生物素标记的探针，用抗生物素蛋白-FITC显示(绿色)
在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。
核酸原位杂交的根本步骤
1.细胞或组织的固定：载玻片 2.组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸外表蛋白质 3.探针的选择和标记
4.杂交 5.杂交结果检测
应用：
探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列
3、复性 变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋的过程。
杂交根本流程
〔一〕核酸分子与固相介质的结合
1.噬菌体/克隆的转移
2.从凝胶上转移DNA:毛细转移、真空转移、 电转移 〔二〕核酸的固定：烘烤〔80℃，2h〕、紫 外、碱
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
精选课件ppt
7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
精选课件ppt
22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸分子杂交1--副本PPT课件
-
10
复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链 全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象, 它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一 般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)。这一术语也用以描述杂 交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温 度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影 响。
便、安全。
-
14
(一）探针的分类
据制备方法及核酸性质不同，可分为：
基因组DNA探针（genomic probe） cDNA探针（cDNA probe） RNA探针（RNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe)
据探针标记物的类型不同： 同位素标记的探针 非同位素标记的探针
-
17
三、核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组 DNA杂交，有必要对探针加以标记， 以便在结合部位获得可识别的信号。
-
18
-
19
核酸分子杂交信号的检测
放射性同位素标记探针： 放射自显影。
非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。
-
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四、核酸分子杂交技术
核酸分子杂交
固相杂交
液相杂交
-
11
应 用：
1）检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系；
2）用来揭示核酸片段中某一特定基因 的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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12
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的
基因或目的DNA特异互补的已知 核苷酸序列。
-
13
理想的探针
1.要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴
定杂交分子。
核酸分子杂交技术李ppt文档
4. 随机引物延伸标记方法
是从单链DNA或RNA模板合成高比活 性的32P标记探针所选用的方法。原理: 使 长 6-8nt 的 寡 核 苷 酸 片 段 与 变 性 的 DNA 或 RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下， 以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为 引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32P dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处 理后，新合成链（探针片段）与模板解离， 即得到无数各种大小的探针DNA。因为所 用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与 模板DNA随机发生退火反应，因此，被称 为随机引物(random primer)。这种随机引 物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。
2. DNA快速核酸标记
大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽 链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶 具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸 外 切 酶 活 性 ， 但 缺 乏 5’→3’ 核 酸 外 切 酶 活 性 。 利 用 Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹 陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’ 末 端 。 用 Klenow 片 段 标 记 末 端 一 般 只 用 一 种 [α-32P] dNTP，加入反应的[α-32P] dNTP取决于延伸的5’末端序 列。
核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可 能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。
标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12 ％的单个碱基被修饰的类似物取代。
尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个 杂交分子的稳定性影响很小。
二、核酸探针的种类
根据标记方法不同可分为：
放射性探针
非放射性探针
核酸分子杂交技术PPT课件
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
.
3
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
.
18
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
.
19
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
.
15
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉
.
9
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo 为21
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
10
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
.
3
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
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（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
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（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
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6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉
.
9
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo 为21
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
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第七章 核酸分子杂交技术与核酸序列测定ppt课件
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
整理版课件
6
复性
RNA
DNA
整理版课件
7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
整理版课件
8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
整理版课件
Home
9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
整理版课件
10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
整理版课件
54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
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6
复性
RNA
DNA
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7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
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8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home
9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
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10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
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54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
分子生物学常用技术杂交 ppt课件
• 探针的制备 • Southern杂交 • 杂交结果的检测
PPT课件 26
PPT课件
27
Southern转膜变性杂交:
1．DNA的变性解链: 数倍体积的1.5mol/L 中1小时 NaCl和0.5mol/L NaOH
2. 中和: 然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和 1.5mol/L NaCl溶液中和1小时 3．转移: 变性DNA在硝酸纤维素膜, 尼龙膜上的固定。硝酸纤维 素滤膜（孔径0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA样品转移或加至硝 酸纤维素膜上后，然后再在80℃真空干燥2h or UV cross link。 4．预杂交: 预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS， 5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切 和DNA酶消化处理，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮 沸变性10min，
PPT课件
11
3、RNA探针：
RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于 RNA 是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高 , 特异性强。
克隆载体体外转录(in vitro transcription)
RNA探针 容易降解
PPT课件
12
4、寡核苷酸探针：
根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的 寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据 蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼 并性。多用于克隆筛选和点突变分析。
来源:
分子克隆 RT- PCR
PPT课件 10
DNA探针（包括cDNA探针）的优点：
①: 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限 繁殖、大量制备、方法简便。 ②: 不易降解（相对RNA而言），DNA酶活性一 般能有效抑制。 ③: DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可 供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位 素和非同位素标记。
基因探针分子杂交技术ppt课件
• 对于因为基因内点突变或基因部分缺失、
重排或插入而引起的遗传性疾病,可以用 DNA探针进行Southern印渍杂交直接加以 分析诊断。 • 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传 性疾病,则需要用DNA探针技术分析限制 性片段长度多态性,以此作为遗传标志作 出分析诊断。 • 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断 或遗传咨询、携带者普查,为防治遗传性
• 二、探针的标记
同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光 素等
xx
地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
• 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定
的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空 白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止 在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是 碱变性，而是采用化学试剂变性法。 • 3、主要用于检测某一组织或细胞中已 知的特异mRNA的表达水平，或比较不同 组织或细胞的同一基因的表达情况。
xx
Western杂交 • 1、基本原理和基本过程与
Southern杂交基本相同 • 2、检测对象为蛋白质（或酶） • 3、SDS-PAGE 电泳分离 • 4、用“抗体-抗原”免疫反应或 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
Molecular probe techniques
基因探针 ——分子杂 交技术
目录
• 简介 •操作步骤 基本原理 • 分类 Southern杂交
Northern杂交 Western 杂交
xx
基因探针
• 基因探针，即核酸探针，是一段带有检
测标记，且序列已知的，与目的基因互 补的核酸序列(DNA或RNA)。
重排或插入而引起的遗传性疾病,可以用 DNA探针进行Southern印渍杂交直接加以 分析诊断。 • 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传 性疾病,则需要用DNA探针技术分析限制 性片段长度多态性,以此作为遗传标志作 出分析诊断。 • 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断 或遗传咨询、携带者普查,为防治遗传性
• 二、探针的标记
同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光 素等
xx
地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
• 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定
的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空 白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止 在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是 碱变性，而是采用化学试剂变性法。 • 3、主要用于检测某一组织或细胞中已 知的特异mRNA的表达水平，或比较不同 组织或细胞的同一基因的表达情况。
xx
Western杂交 • 1、基本原理和基本过程与
Southern杂交基本相同 • 2、检测对象为蛋白质（或酶） • 3、SDS-PAGE 电泳分离 • 4、用“抗体-抗原”免疫反应或 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
Molecular probe techniques
基因探针 ——分子杂 交技术
目录
• 简介 •操作步骤 基本原理 • 分类 Southern杂交
Northern杂交 Western 杂交
xx
基因探针
• 基因探针，即核酸探针，是一段带有检
测标记，且序列已知的，与目的基因互 补的核酸序列(DNA或RNA)。
《基因探针》PPT课件
用的胶有所不同(RNA易形成二级构造)
探针基因的分离制备 同位素或非同位素标记
标记基因探针的纯化
检测样品核酸制备 杂交膜制备或转印
预杂交
杂交
洗膜 图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图
（a）
Southern
（b）
凝胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（ d ） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的基 因DNA片段
一、基因探针
1. 基因探针的类型
1〕DNA酶切片段 2〕用PCR 扩增出的核酸 3〕直接用RNA作探针 4〕人工合成〔含标记〕
2. 基因探针的要求
1〕尽量防止高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要 将polyA或polyT去掉)。 2〕G+C含量：40-60% 3〕探针本身不能有4个连续互补碱基，否那么本身形成二级构 造。 4〕不主张几个连续一样碱基 5〕检测目的核酸时，要考虑模板出现率。〔兼并性〕 6〕探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响 结果。
探针与核酸杂交的方法
▪ 1〕斑点杂交(dot-blot) ▪ 2〕菌落/噬菌斑：转印筛选法 ▪ 3〕组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in
situ hybridization ISH) . ▪ Southern-blot(DNA)、Northern-
blot(RNA) ▪ DNA和RNA操作根本一样，只是电泳所
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
原位杂交
(in situ hybridization ISH)
▪ 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用碱基顺序 并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中 待检测的核酸按碱基配对的原那么进展特 异性结合而形成杂交体，然后再应用与标 记物相应的检测系统，通过组织化学或免 疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成 带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微 镜下进展细胞内定位。
探针基因的分离制备 同位素或非同位素标记
标记基因探针的纯化
检测样品核酸制备 杂交膜制备或转印
预杂交
杂交
洗膜 图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图
（a）
Southern
（b）
凝胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（ d ） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的基 因DNA片段
一、基因探针
1. 基因探针的类型
1〕DNA酶切片段 2〕用PCR 扩增出的核酸 3〕直接用RNA作探针 4〕人工合成〔含标记〕
2. 基因探针的要求
1〕尽量防止高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要 将polyA或polyT去掉)。 2〕G+C含量：40-60% 3〕探针本身不能有4个连续互补碱基，否那么本身形成二级构 造。 4〕不主张几个连续一样碱基 5〕检测目的核酸时，要考虑模板出现率。〔兼并性〕 6〕探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响 结果。
探针与核酸杂交的方法
▪ 1〕斑点杂交(dot-blot) ▪ 2〕菌落/噬菌斑：转印筛选法 ▪ 3〕组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in
situ hybridization ISH) . ▪ Southern-blot(DNA)、Northern-
blot(RNA) ▪ DNA和RNA操作根本一样，只是电泳所
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
原位杂交
(in situ hybridization ISH)
▪ 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用碱基顺序 并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中 待检测的核酸按碱基配对的原那么进展特 异性结合而形成杂交体，然后再应用与标 记物相应的检测系统，通过组织化学或免 疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成 带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微 镜下进展细胞内定位。
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演示课件
杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
演示课件
检测与分析
❖ 1、放射自显影：适用于放 射性同位素标记的探针
❖ 2、比色或化学发光检测： 适于非同位素标记的探针
❖ 通过放射自显影或生化检 测，就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。
演示课件
Northern杂交
探针 核酸 核酸 抗体
演示课件
基本操作程序
印迹
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
演示课件
Southern杂交
LOGO
基因探针 ——分子杂交技术
演示课件
基因探针
❖ 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
演示课件
分子杂交技术的分类
❖ 根据其检测对象不同，可分为
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
检测对象 DNA RNA 蛋白质
演示课件
地高辛：
可以与dCTP连接成 地高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
演示课件
演示课件
杂交 ❖ 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂
液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。
❖ 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
❖ 2、检测对象为蛋白质（或酶） ❖ 3、SDS-PAGE电泳分离 ❖ 4、用“抗体-抗原”免疫反应或
“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
演示课件
LOGO
演示课件
❖ 1、检测对象为RNA。 ❖ 2、与Southern杂交不同的是：1）不需
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱 变性，而是采用化学试剂变性法。 ❖ 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平，或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。
演示课件
Western杂交
❖ 1、基本原理和基本过程与Southern 杂交基本相同
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定分析
演示课件
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
演示课件
电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
演示课件
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
演示课件
转移的方法
❖毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
演示课件
探针的制备 ❖ 一、探针的合成 ❖ PCR、化学合成等方法 ❖ 二、探针的标记 ❖ 同位素：3H、35S、32P等 ❖ 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
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检测与分析
❖ 1、放射自显影：适用于放 射性同位素标记的探针
❖ 2、比色或化学发光检测： 适于非同位素标记的探针
❖ 通过放射自显影或生化检 测，就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。
演示课件
Northern杂交
探针 核酸 核酸 抗体
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基本操作程序
印迹
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
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Southern杂交
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基因探针 ——分子杂交技术
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基因探针
❖ 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
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分子杂交技术的分类
❖ 根据其检测对象不同，可分为
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
检测对象 DNA RNA 蛋白质
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地高辛：
可以与dCTP连接成 地高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
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杂交 ❖ 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂
液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。
❖ 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
❖ 2、检测对象为蛋白质（或酶） ❖ 3、SDS-PAGE电泳分离 ❖ 4、用“抗体-抗原”免疫反应或
“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
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❖ 1、检测对象为RNA。 ❖ 2、与Southern杂交不同的是：1）不需
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱 变性，而是采用化学试剂变性法。 ❖ 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平，或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。
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Western杂交
❖ 1、基本原理和基本过程与Southern 杂交基本相同
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定分析
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检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
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电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
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转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
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转移的方法
❖毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
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探针的制备 ❖ 一、探针的合成 ❖ PCR、化学合成等方法 ❖ 二、探针的标记 ❖ 同位素：3H、35S、32P等 ❖ 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等