基因探针-分子杂交技术(汇总).ppt

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❖ 1、检测对象为RNA。 ❖ 2、与Southern杂交不同的是:1)不需
要限制性核酸酶切;2)变性方法不是碱 变性,而是采用化学试剂变性法。 ❖ 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平,或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。
演示课件
Western杂交
❖ 1、基本原理和基本过程与Southern 杂交基本相同
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交
检测与分析
演示课件
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切,至大小不同的DNA片段
演示课件
电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法:热变性、酸碱
演示课件
杂交炉
安装杂交管
洗膜:经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
演示课件
检测与分析
❖ 1、放射自显影:适用于放 射性同位素标记的探针
❖ 2、比色或化学发光检测: 适于非同位素标记的探针
❖ 通过放射自显影或生化检 测,就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。
演示课件
Northern杂交
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
演示课件
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法,将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
演示课件
转移的方法
❖毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
演示课件
探针的制备 ❖ 一、探针的合成 ❖ PCR、化学合成等方法 ❖ 二、探针的标记 ❖ 同位素:3H、35S、32P等 ❖ 非同位素:地高辛、生物素、荧光素等
❖ 2、检测对象为蛋白质(或酶) ❖ 3、SDS-PAGE电泳分离 ❖ 4、用Hale Waihona Puke Baidu抗体-抗原”免疫反应或
“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
演示课件
LOGO
演示课件
探针 核酸 核酸 抗体
演示课件
基本操作程序
印迹
将样品在凝胶 上分离,然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上(如 滤膜)。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应, 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
演示课件
Southern杂交
LOGO
基因探针 ——分子杂交技术
演示课件
基因探针
❖ 基因探针,即核酸探针,是一段带有检测标记, 且序列已知的,与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
演示课件
分子杂交技术的分类
❖ 根据其检测对象不同,可分为
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
检测对象 DNA RNA 蛋白质
演示课件
地高辛:
可以与dCTP连接成 地高辛-dCTP
原理: 地高辛 + 抗地高辛抗体 (带有荧光素或酶的标记)
演示课件
演示课件
杂交 ❖ 预杂交:将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂
液进行预杂交,也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来,防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。
❖ 杂交:在一定的温度和溶液条件下,将标记的探 针与滤膜混合,如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列,那么探针将与该分子形成杂合双链, 从而吸在滤膜上。
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