分子分型方法在流行病学调查中的应用(景怀琦)

E.coli O157：H7的分子分型方法
徐州地区E.coliO157:H7动物粪便分离株PFGE图谱
ICDC, China CDC
基因芯片的分子诊断研究
基因芯片技术是90 年代兴起的一项前沿生物技术, 它可以将生物学中许多不连 续的分析过程, 移植到固相的介质芯片上, 并使其连续化和微型化。由于它横 跨生命信息、生物物理等众多研究领域, 涉及生命科学、化学、微电子技术、 计算机科学、统计学和生物信息学等诸多自然学科, 故已成为当今多学科交叉、 综合的前沿研究热点。
分子分型方法在流行病学调查中的 应用
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中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所 景怀琦
细菌的分子分型方法
• 近年来分子生物学技术在各个方面得到 广泛地应用，这些技术渗透到流行病学 之中，形成了一门新的分支学科— 分子 流行病学。分子流行病学中重要的一点 是利用合适的分型方法对分离到的病原 进行分析。
细菌的分子分型方法
• 英国把噬菌体分析和PFGE方法结合使用， 对E.coli O157：H7大肠杆菌进行分型。可 以把E.coli O157：H7大肠杆菌至少分为66 个噬菌体型。 • 小肠结肠炎耶尔森菌亦可用噬菌体分型。
细菌的分子分型方法
• 基因分型技术 • 质粒图谱方法 最先应用于流行病学研究 的以DNA为基础的技术就包括质粒的分析。 分别提取分离菌株的质粒DNA，在琼脂糖 凝胶上电泳分离，测定质粒的数目及大 小。该方法简单经济，易于推广。临床 分离的E.coli O157：H7大多数菌株都含有 质粒，可以应用质粒图谱法来进行分型。
细菌的分子分型方法
• 另一方面，如果没有特定的选择压力， 这些遗传元件也可以丢失（如R因子）。 所以，不同的菌株可能具有相同的抗性 图谱，在患者不同时期分离到的同一种 细菌菌株，也可能会表现出不同的抗生 素敏感性图谱。
细菌的分子分型方法
• 噬菌体分型分析 噬菌体裂解细菌细胞具 有一定的特异性。一些噬菌体只能感染 一个种或属的细菌，一些噬菌体可以裂 解同一种细菌的不同株。因此，可以利 用不同噬菌体的裂解细菌细胞的特异性， 可以分离、筛选一组噬菌体，用于传染 源的追踪和菌株的分析。
细菌的分子分型方法
• 基于PCR的分型系统 • 随机引物PCR（AP-PCR），也就是随机 扩增多态性DNA分析（RAPD）。使用那 些不针对任何已知遗传位点的短引物 （通常8-10bp），可以随机地与染色体 DNA结合，并有足够的亲和力启动聚合酶 反应。
细菌的分子分型方法
• 然而，在实践中，用AP-PCR获得可重复 的高分辨力的结果还存在一定的困难。 • 第一，如果条带的强弱可以证明菌株之 间的差异时，我们很难比较和解释图谱； • 第二，由于某些产物可能代表效率相对 低的反应，技术因素的微小改变就可以 导致不同的扩增反应中一个特定菌株产 生的实际片段差别很大。
细菌的分Байду номын сангаас分型方法
• 缺点是除了一些参比实验室外，很少实 验室能拥有种类比较完全的噬菌体，在 应用方面受到了很大的限制。其次，噬 菌体分型技术的要求比较严格，需要经 验丰富的工作人员。同时， 噬菌体分型 常常会遇到多样性结果， 需要仔细推敲。 还有，使用认可的噬菌体，许多菌株不 能获得满意的结果，不得不考虑使用其 它噬菌体， 给结果的分析带来困难。
细菌的分子分型方法
• 总的来说，核糖体分型方法稳定、可重 复。在一般情况下，来源于一个暴发的 菌株有相同的核糖体型.。 • 然而，流行病学上无相关性的菌株经常 有相同的图谱，这就直接限制了该方法 的应用.。
核糖体分型（Ribotyping） Ribotyping指一种特殊的Southern Blot分析 法。在此方法中，用与核糖体操纵单元有 关的RFLP来对菌株进行分析。在国际上 已有完全自动化的仪器，如美国杜邦公司 生产的RiboPrinter Microbial Characterization System，操作快速简便， 完全排除了人为因素对实验结果的影响， 重复性好结果稳定。
细菌的分子分型方法
• 扩增片段长度多态性分析（AFLP）技术。 AFLP的原理：用特异性的酶将细菌染色 体组消化之后，对其消化片段进行选择 性扩增。
细菌的分子分型方法
• 此技术包括三个步骤： • （1）将DNA酶切，并在酶切片段两端连 接上寡聚核苷酸接头， • （2）对一组限制性片段进行选择性扩增， • （3）对扩增片段进行凝胶分析。
细菌的分子分型方法
• 1、抗生素敏感性试验 • 抗生素敏感性测试是临床微生物实验室 常规应用的方法，手工和自动的方法都 可以做到，也可以进行严格地质量控制。 操作简单，相对经济。
细菌的分子分型方法
• 如果要进行详尽的流行病学分析，抗生 素敏感性试验资料的用途就相对有限了。 这不仅是因为表现型有变种的存在，更 是因为现代的医院中，存在中非常大的 抗生素的选择压力。一个特定的菌株， 可以通过多种遗传学机制，“突然”对 某种抗生素表现出抗性。
• 从理论上来讲，AFLP可以应用于所有的 细菌且重复性和分辨力都好。 • 有报道应用于E.coli O157：H7的分子分型。 他们认为，AFLP技术可以作为E.coli O157： H7分子流行病学研究的一种方法。
细菌的分子分型方法
• 核糖体分型（Ribotyping） • Ribotyping指一种特殊的Southern Blot分析 法。在此方法中，用与核糖体操纵单元 有关的RFLP来对菌株进行分析。
• 其操作过程可简述为：将纯化的细菌培 养物用仪器自带的取样棒蘸取并加入样 品缓冲液中，置于热处理器上灭活，然 后加入细胞裂解液使细菌DNA释放。按 照操作程序打开仪器，将样品和试剂放 到固定的位置，该仪器便可进行如下的 自动操作：酶切→电泳→转膜，电泳和 转膜同时完成。转好的膜与结合了化学 发光物质的探针结合（杂交），数码照 相系统通过捕获化学发光物质，对所发 出的光进行拍照，这样我们即可得到最 后的结果。
细菌的分子分型方法
• 一种方法是否能应用于分子分型以及其 分型效果如何大致可以从以下几个方面 考虑：
细菌的分子分型方法
• 1、分型力 是指对所分析菌株能够得到 明确的阳性结果的能力。 • 2、重复性 是指当重复测试相同菌株时 能够得到相同结果。 • 3、鉴别能力 是指区别非相关菌株的能 力。理想的分型方法应该能识别每一无 关的分析菌株。 • 4、结果易于解释 这是非常重要的。 • 5、快速、廉价、技术简单。
细菌的分子分型方法
• 另外一个影响RAPD可重复性的因素或许是由质 粒编码的片段的扩增，质粒是可以丢失或获得 的，有文献报道质粒的影响很小。 • 可重复性差是问题，导致了分辨力的降低，极 大地妨碍了不同实验室之间结果的比较。一些 报道提出使用固定浓度的纯化DNA可以提高可 重复性，从而使此方法有了较好的应用，但操 作起来很困难很烦琐。
细菌的分子分型方法
• 我国部分地区分离到的E.coli O157:H7菌株的PFGE图谱
E.coli O157：H7的分子分型方法
病 人 身 上 ：分 离 到 的的 无 毒 图株 谱的 E.coli O157 H7 PFGE
E.coli O157：H7的分子分型方法
病 人 身 上 ：分 离 到 的的 有 毒 图株 谱的 E.coli O157 H7 PFGE
点样以及结果分析所用的仪器设备 1 点样仪 SDDC-2 arrayer（ VIRTEK）
基因芯片的分子诊断研究
探针和引物的设计与合成 引物在目的基因片段上的位置
基因芯片的诊断开发工作
• 探针的合成、修饰及固定 20 mers探针，5’-端氨基修 饰
Labeled target (DNA or RNA) Capture probe (DNA)
细菌的分子分型方法
细菌的分子分型方法
中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所
细菌的分子分型方法
• 尽管PFGE在许多病原体的分子流行病学研究 中表现出很好的分辨能力，但是具体到应用它 本身就存在着明显的缺点，此种方法耗时、耗 力而且对设备的要求也很严格。况且，当 PFGE的图形匹配得不是很好的时候，其结果 依然难以解释。况且， 也不能够仅仅以PFGE 的结果为依据。
细菌的分子分型方法
• 在实际应用过程中，任何单一的方法所 得出的结论都具有片面性，所以，联合 应用几种方法是目前较为理想的分子分 型方法。
细菌的分子分型方法
• 这其中又以PFGE与其它方法相结合的效 果为最佳，先用分辨力较低的方法进行 初筛，然后用分辨力较高的方法进行进 一步的分型，这是目前大多数实验室所 采取的策略。随着科学技术的发展和进 步，会有更好的方法问世。
细菌的分子分型方法
• 其引物是根据接头和酶切位点的序列来 确定的。由于其引物延伸至限制性片段 内部，所以只有限制性位点两侧的核苷 酸序列与引物延伸端匹配的片段才能被 扩增，这样就实现了选择性扩增。使用 这种方法，在不知道核苷酸序列的情况 下，就可以应用PCR观察到一组限制性片 段。
细菌的分子分型方法
细菌的分子分型方法
• 然而，细菌的质粒可以自发丢失（如小 肠结肠炎耶尔森菌质粒的自然丢失率在 10%左右，且这种丢失是不可逆的）、获 得质粒。还可以在细菌之间进行接合转 移，这就使得质粒图谱分析的结果有时 候难以解释。 • 另一个问题是质粒DNA构型可能发生改变。
细菌的分子分型方法
• 此外，使用质粒图谱分析方法不能够区 分那些分子量相同而DNA序列不同的质粒， 或分子量不同而有较高同源性的质粒。 • 针对这一情况，人们把质粒用限制性内 切酶消化，再用电泳分析限制性片段的 数目和大小，这样质粒分析的可重复性 和分辨力都会得到很大的提高。
细菌的分子分型方法
• 尽管如此， PFGE分析技术在O157：H7大肠杆 菌的分子流行病学分析中得到了广泛的应用， 也是目前最推崇的方法。美国CDC已经建立一 个O157：H7的PFGE图谱的网上数据库，为疾病 的监测和调查提供有力的依据和帮助。但是， 目前这个数据库的使用还有着严格的限制， 并非所有的科学家都能够使用。
细菌的分子分型方法
• 五、脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 这一方
法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电 场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里， 直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向 前移动。DNA分子越大，这种重排所需要的时 间就越长。若DNA分子变换方向的时间小于电 脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分开。
• 靶DNA的扩增与荧光标记 dUTP-Cy3 • PCR产物的纯化与测定
• 我们利用这一系统提供的核糖体基因 DNA指纹的相似度值和鉴定结果，便可 进行分型。我们利用本系统对我国分离 的部分O：3，O：9小肠结肠炎耶尔森菌 进行了分型，这种分型基本上和血清型 相符合（见图）。
型分体糖核的株菌型清血 9：Ｏ表代别分、 6、 5、 4、 3、 2、 1： 3 图 果结型分体糖核的株菌型清血 3：Ｏ表代 8、 7，果结
细菌的分子分型方法
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肠道致病性的分型技术大致如下：
1、表现型分型方法。 抗生素敏感性 噬菌体分型
细菌的分子分型方法
• 2、基因分型技术， • A 质粒图谱分析 • B 以PCR为基础的分型方法，如随机扩 增多态性分析法（RAPD）、扩增片段长 度多态性（AFLP）； • C 限制性片段长度多态性（RFLPs）的 Southern Blot分析。 • D 脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）。
1 杂交模型的建立 • 现有病原体的分子生物学检测方法通常需36~48小时 • Real-time PCR可在1h内得到结果，但有其局限性 • 基因芯片可同时检测多个病原体的许多参数 • 选择的探针具有敏感、重复性好的杂交信号 2 其它实验条件的探索和优化
基因芯片的分子诊断研究
基本的技术路线
0,6 nl per spot (spacing = 0,5 mm) 108 to 1013 oligonucleotides/µ l (~105 to 1010 oligos/spot) 2 扫描仪 ScanArray 4000XL（GSI Lumonics）