月季的花药培养

某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙 花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染 成蓝黑色。
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鉴定花粉： ①最常用的方法是醋酸洋红法： 花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花 药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成 红色） ②某些植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花 青—铬钒法： 花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于 载玻片上→焙花青－铬钒溶液染色→盖上盖玻片→镜 检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）
1个
小孢子 （小孢子四分体时期
4个
4个
单核居中期
4个
单核靠边期
4个
有丝
双核期）
分裂
花粉管细胞核 生殖细胞核
4个
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营养细胞
生殖细胞
有分 丝裂
精子
8个
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小孢子母细胞 （2n）
减数分裂
4×2个精子 (n)
有丝分裂
小孢子四分体 时期（n）
4个生殖细胞 4个营养细胞
（n）
（n）
单核居中期 （n）
单核靠边期 （n）
•注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成， 醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以
确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边
期。一般单核靠边期的花药培养. 成功率最高。
•（二）材料的消毒
1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒 2、无菌水清洗 3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分 4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟
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⑷选择最合适的花粉发育时期——是提高诱导 成功率的重要因素
• 原因：不是任何时期的花粉都可以经过培养 产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程 中只有一个时期对离体刺激敏感。一般来说 细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培 养成功率最高。
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①不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩， 容易破碎；
②不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动， 给材料消毒带来困难；
形成大量的花粉母细胞（小孢子母细胞）。
花粉 花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形
成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。
➢ 被子植物花粉的发育要经历： 四分体时期、单核期和双核期等阶段。
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基础知识
一、被子植物的花粉发育
阅读课本P37～P38
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花粉发育过程
减
有
数
丝
分
分
裂
裂
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小
孢减
子数
母 细
分 裂
胞
花粉 母细 胞
（花粉粒）
花
柱头
精子2个（生殖细胞核）
花柱
雌蕊 （精子2个）卵细胞（1个）1个精子 受精卵 胚
胚珠 极核（2个）1个精子 受精极核 胚乳 种子
子房
珠被
种皮
果实
子房壁
果皮
根、茎、叶
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（二）产生花粉植株的两种途径
花药中的花粉 脱
分 化
分化
胚状体
丛芽
诱
再分化
导
花药中的花粉 愈伤组织 丛芽
生根
移栽
愈伤组织
• 材料的低温预处理（延缓小孢子衰老）、 接种密度、培养的环境条件等对诱导的 成功率都有一定的影响。
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三、实验操作
（一）材料的选取 （二）材料的消毒 （三）接种和培养
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三、 实验操作
（一） 材料的选取
1. 选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是 否处于适宜的发育期。
2. 最常用的方法：醋酸洋红法、焙花青—铬矾法。
胚状体
丛芽
说明：两种途径之间并没有绝对的界限， 主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
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人 工 种 子
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（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择：
⑴不同种类植物的诱导成功率不同。 ⑵同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成 功率有直接影响。 ⑶合适的花粉发育时期：花期早期时的花药比 后期更容易产生花粉植株。一般月季的花药培 养选择五月初到五月中旬，即月季的初花期。
③挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放 的花蕾，菌少，易消毒。
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2、培养基的组成
花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节 剂的水平和配比起决定作用。 ⑴诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用2， 4-D、IAA和KT； ⑵诱导分化的培养基常除去2，4-D而以IBA或BA等代之。
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3、其他因素：
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每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左 右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。
经过20-30天培养后，会发现花药开裂， 长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及 时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再 生植株。
如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药 内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后 尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基 上，否则这些植株将很难分开。
课题2 月季的花药培养
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植物花药离体培养的意义
缩短了 育种周期， 为新品种的 培育开辟了 新途径。
花粉粒（1N）
单倍体植株 （1N）
二倍体纯合子 植株（2N）
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花的结构
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二、 基础知识
（一）被子植物的花粉发育 ➢花粉：
雄蕊 花丝 花药
雄蕊 囊状结构，内有很多花粉粒
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花粉囊 当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会
3、接种是否成功
如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体， 花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基， 以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。
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对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛 选。因为在花药培养中，特别是通过愈伤组 织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性 的变化。
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四、 结果分析与评价
1、选材是否恰当
选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通 过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。
2、无菌技术是否过关
如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培 养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。
（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白 粉溶液） 5、无菌水冲洗3～5次
用于培养花药，实际上多数未熟，由于它 的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌 状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
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（三）接种和培养
灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片 和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。
在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则 接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组 织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相 连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。
4个生殖细胞 4个花粉管细胞 核（n） 核（n）
有丝分裂
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双核期
卵细胞的形成
大孢子 减数 4个大孢子（3 3次核 母细胞 分裂 个退化消失） 分裂
1个卵细胞 5个其它细胞 2个极核
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成熟胚囊的结构与功能
极核2:与一精子结合,发育 成胚乳
卵细胞1:雌配子,受精后发 育成胚.
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雄蕊（花药）
花粉管细胞核（营养细胞核）