辽东楤木叶总皂苷逆转卵巢癌细胞耐药作用的实验研究

·博士论坛·基金项目：黑龙江省政府博士后启动基金（No．LRB05－255）；哈尔滨市科技创新专项基金（No．2010FRXXS052）；教育部博士点基金（No．20102307110003D200952）作者单位：1．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；2．哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150081通讯作者：张广美，Email ：zayswxy@126．com 辽东楤木叶总皂苷逆转卵巢癌细胞耐药作用的实验研究王春梅1，2张广美2【摘要】目的探讨辽东楤木叶总皂苷对上皮性卵巢癌细胞耐顺铂株的抑制作用及其逆转耐药的作用机理。

方法采用MTT 法检测辽东楤木叶总皂苷对SKOV3－DDP 细胞的抑制作用，绘制抑制曲线；TUNEL 法检测辽东楤木叶总皂苷促进SKOV3－DDP 细胞凋亡的作用；蛋白印迹法检测相关耐药蛋白的表达；流式细胞仪检测辽东楤木叶总皂苷对SKOV3－DDP 细胞周期进程的影响。

结果辽东楤木叶总皂苷可有效抑制卵巢癌耐顺铂株的生长，且这种抑制作用具有浓度—时间依赖性；辽东楤木叶总皂苷可促使SKOV3－DDP 细胞周期停滞于G1期，诱导细胞发生凋亡；辽东楤木叶总皂苷可降低SKOV3－DDP 细胞耐药蛋白的表达。

结论辽东楤木叶总皂苷可抑制SKOV3－DDP 细胞的生长，这种作用可能与其促使细胞周期停滞、诱导细胞凋亡、降低耐药蛋白的表达相关。

【关键词】辽东楤木；耐药；抗肿瘤；三萜皂苷【中图分类号】R737．31【文献标识码】A 【文章编号】1673－6613（2012）08－0713－04Experimental Research of the General Saponins of Aralia Elata Leaves on its Reversal of Drug Resistance for Ovary Cancer CellsWANG Chun －mei 1，2，ZHANG Guang －mei 2（1．Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine ，Harbin Heilongjiang 150040；2．No．1Affiliated Hospital of Harbin Medical University ，Harbin Heilongjiang 150081）【Abstract 】Objective To explore the mechanisms on the inhibition of TALAS （general saponins of aralia elata leaves ）on SKOV3－DDP cells and the mechanism of its reversal of drug resistance．Methods MTT assay was used to detect the inhibition of TALAS on SKOV3－DDP cells to draw the inhibition curve．TUNEL assay was applied to detect the promotion of TALAS on SKOV3－DDP apoptosis．The western blotting was adopted to detect the expressions of relevant drug －resistance proteins．The flow cytometry was provided to detect the impacts of TALAS on the progression of SKOV3－DDP cell period．Results TALAS effectively inhibited the growth of cisplatin resistance on ovarian cancer cell strain．This inhibition presented the concen-tration －time dependence．TALAS forced SKOV3－DDP cell period to be arrested at G1stage and induced apoptosis．TALAS reduced the expressions of drug －resistance proteins of SKOV3－DDP cells．Conclusion TALAS inhibits the growth of SKOV3－DDP cells ，which is probably related to that TALAS promotes the cell period arrest ，induces apoptosis and reduces the expressions of drug －resistance proteins．【Key words 】Aralia Elata ；Drug Resistance ；Anti －Cancer ；Triterpenoid Saponins卵巢癌为致死率最高的妇科肿瘤，常规的治疗方法以手术为主，化疗、放疗为辅。

由于对铂类药物耐药等原因，五年生存率低于45%［1－2］，肿瘤化疗耐药问题已经成为肿瘤治疗的关键问题之一。

辽东楤木，又名刺老芽、龙牙楤木，为我国东北地区常见山野菜［3］，实验证明辽东楤木叶总皂苷（TA-LAS ）具有抑制卵巢癌细胞生长的作用［4］，本实验拟探讨辽东楤木叶总皂苷抑制卵巢癌耐药株的生长并逆转卵巢癌细胞耐药的作用。

材料与方法一、实验材料1．细胞系及培养：上皮性卵巢癌细胞耐顺铂株（SKOV3－DDP ）由中国肿瘤研究所馈赠，SKOV3－DDP 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI －1640培养液中，其中加入0．1%的青－链霉素和0．3%谷氨酰胺，37ħ、5%CO2恒温培养箱培养，每隔3d传一代，取对数生长期细胞用于以下实验。

2．药物及试剂：辽东楤木叶总皂苷（粉末状、褐色、易溶于水，室温保存）由黑龙江中医药大学，中药化学教研室，匡海学教授赠送，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液配成1000μg·mL－1的母液，－20ħ保存，根据实验需求配成相应浓度。

RP-MI－1640培养液（HyClone，美国，HC－3608）；胎牛血清（NQBB，澳大利亚，NQ－08－325）；TUNEL原位凋亡检测试剂盒（罗氏，瑞士，批号：1168481791）；蛋白分子量标准（碧云天，中国）；鼠抗人－LRP抗体（BD公司，美国，批号：BA0656）；鼠抗人－MDR－1抗体（BD公司，美国，批号：MK2522）；内参β－actin （San－KL－006）、马抗小鼠IgG（San－KL－028）（北京中衫金桥，SANTA CRUZ进口分装）；MTT （SML－010）、DMSO（S9321）、PI（P4170）、RNase A （90436528）（sigmal，美国）。

3．实验耗材及仪器设备：细胞培养瓶、细胞培养板等耗材（corning）；DYY－12型电泳仪（北京六一仪器厂）；GDS－8000凝胶成像仪（UVP，美国）；流式细胞仪（BD，美国）；多功能酶标仪（Biotek，美国）等。

二、实验方法1．MTT法检测辽东楤木叶总皂苷（TALAS）对SKOV3－DDP细胞生长的抑制作用：对数生长期SKOV3－DDP细胞以每孔5ˑ103个种于96孔培养板中，每组设五个副孔，周边孔用PBS填补，培养过夜，加入不同浓度LATS，并设立阴性对照组（不加药，只加培养液）及空白对照组（不加细胞，只加培养液），分别培养24、48、72h后，每孔加入20μL MTT，37ħ孵育4h。

吸出上清液，各孔加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，酶标仪测定570nm波长时各孔的吸光度值。

根据公式：细胞增殖抑制率=［1－验组A值/（对照组A值－空白组A值）］ˑ100%，计算抑制率，SPSS13．0制作抑制曲线。

2．TUNEL法检测细胞凋亡：对数生长期SKOV3－DDP细胞以每孔2ˑ105个种植于6孔细胞培养板中，培养24h后，分为对照组，低剂量组（50μg·mL－1），中剂量组（100μg·mL－1），高剂量组（200μg·mL－1），弃上清液，分别加入不同浓度药液，继续培养24h。

依据TUNEL原位凋亡检测试剂盒说明书检测，用荧光倒置显微镜观察，绿色荧光染色细胞为凋亡细胞，实验重复三次。

3．蛋白印迹法检测耐药蛋白的表达：对数生长期SKOV3－DDP细胞于细胞培养瓶中培养过夜，分为对照组，低剂量组（50μg·mL－1），中剂量组（100μg·mL－1），高剂量组（200μg·mL－1），继续培养24h，各组收集细胞，裂解液裂解1h，每隔15min涡旋一次，11400g·m－1品浓度，将样品与上样缓冲液（含β－巯基乙醇）混匀，99ħ煮5min。

根据浓度计算上样量，进行聚丙烯胺凝胶电泳1．5h，再将蛋白质转到硝酸纤维素膜上（2h），1%BSA封闭过夜，鼠抗人－LRP抗体、鼠抗人－MDR－1单克隆抗体按1ʒ1000稀释，β－actin按1ʒ300稀释，一抗孵育2h，二抗孵育2h，DAB显色5 10min，UVP凝胶成像仪照相，分析结果。

4．流式细胞仪检测细胞周期的变化：对数生长期SKOV3－DDP细胞于六孔培养板中培养过夜，分为对照组，低剂量组（50μg·mL－1），中剂量组（100μg·mL－1），高剂量组（200μg·mL－1），继续培养24h。

收集细胞，PBS液冲洗3遍，75%冰乙醇固定48h后，PBS液再冲洗3遍，1500g离心5min，37ħPI染色30min，流式细胞仪检测细胞周期的改变。

三、统计学处理ModFit LT软件分析结果，实验重复3次，取平均值。

结果1．TALAS对SKOV3－DDP细胞的抑制作用：MTT法检测LATS分别作用24、48、72h后，SKOV3－DDP细胞的生长情况，如图1所示，TALAS对SK-OV3－DDP的抑制作用具有浓度—时间依赖性，即：随TALAS浓度增高，作用时间延长，对SKOV3－DDP的抑制作用亦随之增强。

图1TALAS作用24、48、72h后，对SKOV3－DDP细胞生长的抑制作用2．TUNEL法检测TALAS对SKOV3－DDP细胞促凋亡作用：应用原位凋亡检测试剂盒检测TALAS 对SKOV3－DDP 细胞的促凋亡作用，如图2所示，正常对照组仅见少量细胞凋亡，而加药组随着药物浓度的增加细胞的凋亡率亦随之增加，且具有浓度依赖性。