第3章 植物胚培养

附加成分
3、培养条件
通常会下降 12小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30C
第一节 植物胚胎培养
五、幼胚培养方法
• （一）材料的选择与灭菌
• （二）幼胚的分离及培养
第一节 植物胚胎培养
• （一）材料的选择与灭菌 • 取材时期：大多数幼胚成功的实例证明，多为心形 胚至鱼雷形胚。 • 操作：取回大田或温室里授粉受精后的植物子房， 用70%的酒精进行表面消毒，再用0.1%氯化汞灭菌 10-30min，用无菌水冲洗3-4次，即可用于胚的分离 和培养。 • 次氯酸钠：5%的次氯酸钠处理5-7min用无菌水冲洗 3-4次，即可用于胚的分离和培养。
继代的次数越多，倍性越不稳定。
第二节 植物胚乳培养 （一）胚乳外植体的制备
• 有较大的胚乳的种子，消毒剥去种皮， 培养 • 胚乳外有粘性物质包裹的，消毒、去皮、 去粘液，取出胚乳组织培养
• 有果实的种子，将果实消毒，切开幼果， 取出种子，分离出胚乳组织进行培养
第二节 植物胚乳培养
（二）胚乳愈伤组织的建立
第二节 植物胚乳培养
目前研究概况
• 12科，40多种。 • 蔷薇科：苹果，梨，桃。 • 禾本科：大麦、玉米和水稻。 • 茄科：枸杞、马铃薯。
第二节 植物胚乳培养 一、胚乳培养方法
1、胚乳外植体的选择制备。游离核型期材料难 以培养，而细胞型期的材料易于成功。从盛花 期后胚乳组织进入细胞型期的是时间玉米为812天，小麦为8天，黄瓜为7-16天 2、胚乳愈伤组织的诱导及器官分化： （1）器官发生途径 （2）胚胎发生途径
第二节 植物胚乳培养
胚乳发育时期的影响： 1.发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织 的诱导频率很低。 2.处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易 诱导产生愈伤组织，诱导率最高，可达9095% 。 3.接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱 导频率很低。
第二节 植物胚乳培养 胚乳发育时期
• 例如： • 玉米在授粉后8-12d的胚乳适合离体培养。 • 水稻在授粉后4-7d的胚乳适合离体培养。 • 小麦在授粉后8-12d的胚乳适合离体培养。 • 大麦在授粉后10-20d的胚乳适合离体培养。
1. 培养基
第一节 植物胚胎培养
胚乳看护培养
• 大麦离体胚，在含有同种胚乳的培养基 中，对胚的生长促进。 • 大麦离体胚，在含有异种胚乳的培养基 中，对胚的生长促进作用更强。 • 大麦×黑麦杂交胚，在含有大麦胚乳的 培养基中，成苗率提高30-40%。
第一节 植物胚胎培养 2.环境条件
• 温度：胚培养25-30℃ • 光照：黑暗或弱光，光对胚胎发 育有轻微抑制作用
• 时间: 早于胚的发育，一般不经过休眠。 • 类型:核型胚乳、细胞型胚乳、沼生目型胚乳 1、核型胚乳: 普遍的形式，胚乳的早期发育有一个游离核 时期，先期核多次分裂，但不形成细胞壁， 称为游离核形成期。发育后期产生细胞壁， 形成胚乳细胞，为核型胚乳。不同倍性的愈 伤组织。
第二节 植物胚乳培养
2、细胞型胚乳：无游离状态，核的 分裂伴随壁的形成。双子叶的合瓣花 （烟草、番茄） 3、沼生目型胚乳：初生胚乳核移到 合点端后分裂，形成一个合点小室和 株孔端大室。株孔端核再游离核分裂， 后期形成细胞壁。
（1）直接引入法，用刀片在子房壁上开个切口，把花粉 悬浮液滴于切口处 （2）注射法，在子房上切2个注射孔，一个在子房顶端， 一个在其对面靠近子房基部，用注射器吸取花粉悬液从 基部注射孔注入。当从另一端溢出时，用凡士林封闭两 个孔，将子房接种于培养基上。 3、雌蕊离体授粉，在花药尚未开列开裂时切取母本花 蕾，消毒后在无菌的条件下除去花瓣、雄蕊、保留萼片， 将整个雌蕊接种于培养基上，在培养的当天或次日在其 柱头上授以无菌的父本花粉。
第四节 植物离体授粉
离 体 授 粉
的
三 种 方 式
第四节
二
植物离体授粉
离体授粉的方法
• 实验材料的选择 选用子房大有多个胚珠的植物，如茄科、 玉米,多保留母体花器官组织有利于离体授 粉成功。 • 离体授粉程序 确定时间—去雄套袋---制备无菌子房 或胚珠—制备无菌花粉---试管授粉
1、胚珠试管受精 （1）取胚珠，将子房表面消毒，在无菌的条件下将子房 剥下，除去花托，取出带胚座的裸露胚珠，接种于配好的 培养基上。 （2）人工授粉，一种是在接种好的胚珠表面授以无菌的 花粉，二是先培养花粉，然后将胚珠接种在有花粉的培养 基上。 钙、硼离子对花粉萌发和花分管生长的促进有重要作用 2、子房离体授粉。通过人工的方法把花粉直接引入子房 使花粉粒在子房腔内萌发并完成受精过程。这样可以使花粉 管不经过柱头和花柱组织，直接进入子房中的胚珠，有可能 克服孢子体不亲和现象，从而获得远缘杂交种。
第三节 植物胚珠和子房培养
培养方法
• 外植体的制备与胚珠培养方法相似 • 培养基 • 椰子汁、酵母提取物（YE）、B族维 生素 IAA
第四节 植物离体授粉
一、含义：在人工控制下将未授粉的胚珠或 子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并 以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内 实现受精的技术，也称试管受精，离体受精。 • 方法： • 离体柱头授粉 • 离体子房授粉 • 离体胚珠授粉
第三章
植物胚胎培养
第三章 植物胚胎培养
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节 植物胚培养 植物胚乳培养 植物胚珠和子房培养 植物离体授粉
第一节 植物胚胎培养
一、胚培养的概念
胚培养： 胚挽救： 1、杂种幼胚在人工培养基上培养 2、杂种幼胚的胚乳看护培养 3、杂种幼胚的愈伤组织培养
第一节植物胚胎培养
影响胚乳细胞染色体稳定性的因素
胚乳的类型
培养基中外源激素的种类和含量：激素的配比不仅 决定胚乳细胞的 增值和分化Hale Waihona Puke Baidu还影响胚乳细胞 染色体的倍性变化
造成染色体倍性变化的主要原因有： 培养基中的外源激素。 猕猴桃的确胚乳培养中，当培养基中含有3.0mg/L Zt +0.5-1.0mg/L 2,4-D时产生的植株多是三倍体，而 在3.0mg/L Zt +0.5-1.0mg/L NAA时产生的植株多数不 是三倍体。
第一节 植物胚胎培养
• 胚龄和胚的发育形态
一般认为胚龄是影响胚培养成功的关键 因素之一。 1、球型胚:成苗少,苗发育不良,缺叶绿素,子 叶不发生。 2、心型胚:叶小白色,真叶发生需3-4周,后面 的生长也不良。 3、鱼雷胚:叶绿色,展开的子叶大,苗发育较前 两时期好。
第一节 植物胚胎培养
• （二）幼胚的分离及培养 • 幼胚剥离：幼胚是一种半透明、高粘稠状组织， 剥离过程极易失水干缩，因此操作速度要迅速。 胚柄参与幼胚的发育，取材时应带胚柄。 • 接种培养： 休眠、春化作用、胚萌发温度等。
• 1.愈伤组织诱导 胚乳接种到培养基上6-7d，细胞 分裂，形成原始细胞团，即为愈伤组织。 • 2.形态建成 • 器官发生：要分化必须选择特定的激素和附加物。 例如（枸杞：BA、BA+NAA分化77-85%：猕猴 桃：ZT） • 体胚发生：柑橘、桃、枣
第二节 植物胚乳培养 （三）倍体后代特征
• 1.形态特征 被子植物通过胚乳培养得到三倍体植株， 产生无籽果实。
第一节 植物胚胎培养 3.胚柄
• 胚柄是一个短命结构，球形胚时期， 胚柄发育成最大。 • 胚柄参与幼胚的发育 • 5mg/L赤霉素能有效的取代胚柄的 作用
第二节 植物胚乳培养
• 胚乳（endosperm）一般是指被子 植物的胚乳是三倍体由两个中央极 核与一个精核结合而成；裸子植物 的胚乳是单倍体（由大孢子发育而 来）。
第一节 植物胚胎培养
•
•
葡萄胚挽救的几个步骤图例： a.取材料
第一节 植物胚胎培养
材料处理，灭菌剥胚
第一节 植物胚胎培养 取胚
第一节 植物胚胎培养
胚发育阶段
第一节 植物胚胎培养
正常成苗
第一节 植物胚胎培养 培养室炼苗
第一节 植物胚胎培养 温室炼苗
第一节 植物胚胎培养 移栽大田，生长为壮苗
• 2.胚乳再生植株的倍性 染色体常常发生变化；同一植株往往是 不同倍性的嵌合体；倍性混乱在胚乳培 养中相当普遍
第二节 植物胚乳培养 二、影响胚乳培养的因素
• 1.植物外植体 胚乳发生类型和发育程度 胚在胚乳培养中的作用 • 2. 培养基与激素 • 3. 培养条件
第二节 植物胚乳培养
胚乳的发育类型
第一节 植物胚胎培养 愈伤组织途径
离体胚
愈伤组织 胚状体或不定芽 小植株
激素浓度高
分化培养基
第一节 植物胚胎培养 四、成熟胚的培养
1、材料的消毒与接种 2、培养基
大量元素和微量的无机盐为基本成分 谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长 植物天然浸提物（YE）促进胚生长 硫氨素促进胚根的伸长 生长素低浓度促进胚的发育（胚根） 赤霉素促进有后熟作用的种子萌发 pH一般为5.5-6.0、加热灭菌后PH
• 植物胚乳培养含义：将胚乳组织从母体 上分离出来，通过离体培养，使其发育 成完整植株的技术。
胚乳的产生
第二节 植物胚乳培养 胚乳培养的探讨
胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills 首例进行了玉米胚乳培养。 胚乳细胞的全能性。 大多数被子植物的胚乳是三倍体。 胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢 途径的理想系统。
第二节 植物胚乳培养 胚在胚乳培养中的作用
• 胚乳培养中两种方式：带胚培养和不带胚培养 带胚培养（早期胚乳）更容易形成愈伤组织 处于生长旺盛期的胚乳不需要胚，生理活性微 弱的胚乳(完全成熟的胚乳）必须借助于胚的增 殖作用 • 赤霉素可替代胚的作用
第二节 植物胚乳培养
培养基与培养条件
• 培养基：MS、水解酪蛋白、酵 母提取物、蔗糖、外源激素、 pH • 温度：25℃ • 光照：因物种而异
原胚-球型胚-心形胚-鱼雷胚-成熟胚-小苗。
第3章
胚胎培养
胚的发育
种子的结构
第一节 植物胚胎培养
二、胚培养的意义
用于胚的挽救获得远缘杂种 打破种子休眠，缩短育种年限 诱导胚状体及胚性愈伤组织 种子生活力的快速测定 克服株心肧的干扰
第一节 植物胚胎培养
成熟胚培养
三、胚培养的类型
成熟胚一般指从种子中剥离的发育完全的胚。它培养容易成功,成熟 胚材料不受季节性限制。实质是胚的离体萌发过程 离休胚培养的发育方式 ： 1. 合子胚发育途径；由合子形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶 形胚，形成完整的种子，成苗 2. 胚的早熟萌发；幼胚离体培养不经历休眠过程，不经历完整的胚 胎发育过程而形成幼苗的现象叫做早熟萌发。 3. 脱分化形成愈伤组织。幼小的胚在离体培养时多数情况下脱分化 形成愈伤组织。主要原因为培养基中成分不适宜
• 胚的发育：植物在受精后就开始胚发育。 由于胚处在胚囊中，胚囊可以供给胚发育 的特殊营养物质。 • 胚的发育包括原胚时期-球型胚-心型胚-鱼 雷胚-成熟胚。 胚发育越小，培养时就需要更多更复 杂的营养物质。
第一节 植物胚胎培养
• 胚发育可分为异养和自养两个阶段。 • 异养阶段:在此阶段,胚主要依靠胚乳 及周围的母体组织吸取养分. • 自养阶段:开始于心形胚后期，此时， 胚在代谢上已能由基本的无机盐和糖 合成生长所需要的物质.
第三节 植物胚珠和子房培养
胚 珠 的 结 构
胚囊 内珠被 外珠被 珠柄
第三节 植物胚珠和子房培养
一、胚珠培养
• 含义：将胚珠从母体上分离出来，在 人工控制下，进行离体培养，使其生 长发育形成幼苗的技术。 • 类型：受精胚珠培养、未受精胚珠培 养
倒生胚珠
第三节 植物胚珠和子房培养
一胚珠培养方法
第一节 植物胚胎培养 幼胚培养的关键技术：
取材时期 幼胚剥离 培养基设计 培养条件的控制（是否需要特殊处理）
第一节 植物胚胎培养 六、幼胚培养条件
培养基 环境条件
植物材料：胚柄
第一节 植物胚胎培养
• 基本培养基：MS N6 White等 • 糖的作用：蔗糖是最好的碳源之一，主要调解渗 透压的作用 • 无机氮以硝酸盐、铵盐的形式存在可以提高钾和 钙的浓度 • 氨基酸：谷氨酰胺刺激胚的生长；水解蛋白 • 维生素：促进幼胚的早期发育 • 植物生长调节剂 • 天然有机物：胚乳看护培养
• 1.材料的选择和灭菌 • 2.培养基对胚珠培养的影响 • 3.胎座和子房对胚珠培养的影响
• 4.胚发育时期的影响
第三节 植物胚珠和子房培养 二、子房培养
• 含义：将子房从母体上分离下来， 置于培养基上，使其发育成幼苗的 技术。 • 子房：由子房壁、胎座、胚珠组成
胚珠和子房培养
雌蕊与子房的类型