第十章有机高分子基质HPLC填料
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第十章有机高分子基质HPLC填料
三、填料性能评价
• 填料的物化性质指标 • 填料的色谱性能表征
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、物化性质指标:
a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度ρg(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、
溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度Ψ； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。
多糖型凝胶 高聚物树脂
➢基质微球——天然多 糖或合成单体或交联剂 ➢负载样品的能力强， 色谱容量高 ➢耐酸碱、具化学稳定 性，柱寿命长，易再生 ➢不易产生非特异性吸 附作用
无机基质
硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石
石墨化碳黑
第十章有机高分子基质HPLC填料
一、HPLC色谱柱的关键在于填料
• 物理结构→色谱动力学
第十章有机高分子基质HPLC填料
2.琼脂糖系:
① Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝 胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)
② 高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow
(Sepharose 6FF, Sepharose 4FF)
③ 高效琼脂糖凝胶Sepharose high Performance
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、色谱性能表征:
① 保留值：
保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)
② 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动
相及温度有关。
③ 柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。 ④ 填充柱的总空隙度和穿透性： ⑤ 分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰
与经典色谱的比较
色谱法 固定相粒度 柱长及内径 采用压力 分析速度 经典 大于 100μm 10-100cm φ2-5cm 常压 几十小时 高效 5－10μm 10-30cm φ1-5mm 107Pa 几分钟
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC分离填料：
有机基质
可分为:
多糖型 聚合物型
第十章有机高分子基质HPLC填料
（一）多糖型基质材料
1.葡聚糖系:
① 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小 而且分布范围窄（10~23µm）;
Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和
高效色谱 ② 烯丙基葡聚糖与N,N`-亚甲基双丙烯酰胺交联共
聚而成的凝胶。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属 于高效凝胶，较高流速下使用
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避
底宽度一半之和的比值。
第十章有机高分子基质HPLC填料
四、反相HPLC高分子填料
Reversed Phase Chromatography,RPC
反相色谱（原理参照P237） ：非极性
固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主， 特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。
① 特定的选择性; ② 良好的化学稳定性及热稳定性; ③ 避免不可逆吸附。
不同填料的化学结构是通过对基质材料的 化学改性而实现的。
第十Leabharlann Baidu有机高分子基质HPLC填料
离子交换色谱填料
颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强 弱阴阳离子集团。
反相色谱填料
C18、C8烷基等疏水性集团
正相色谱填料
以多糖凝胶为基质的产 品，颗粒都>20µm左右
以合成树脂为基 质的产品，颗粒 <7µm
同左
第十章有机高分子基质HPLC填料
目前的主要发展方向(研究热点):
① 颗粒单分散的填料; ② 贯穿性超大孔结构的填料; ③ 小颗粒的非多孔填料。
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求
Superdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速 Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶
第十章有机高分子基质HPLC填料
（二）聚合物型基质材料
• 交联聚苯乙烯树脂:
苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)， 是应用最为广泛的一类基质树脂。
• 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:
以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、 环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。
免复杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
第十章有机高分子基质HPLC填料
常见的液相色谱填料类型
多孔型
分：小孔（<10nm）、中 孔（10-30nm）、大孔 （>30nm）和超大孔 （>100nm），应用占主 导地位
非多孔型
整体颗粒无孔
薄壳型
颗粒表面层多 孔，内部无孔。
以合成树脂为基质的产 品，颗粒在10µm左右
分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作 参数选择广泛;
分离纯化+分析检测; 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监
测和自动化操作。
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC的关键设备
① 专用的高压输液系统; ② 高灵敏检测系统; ③ 高效分离柱
• 其中分离柱是色谱的中心, 是最为关键的部分
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章 有机高分子基质的高效液 相色谱分离柱填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
首先回顾几个问题
• HPLC方法的主要特点有那些？ • HPLC的主要设备分哪几部分？
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC方法的主要特点
分离效率高，选择性好，适于各种多元组 分复杂化合物的分离;
应用范围广：无机物—有机物，天然物质 —合成产物，小分子---大分子，一般化合 物到生物活性物质;
羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团
亲和色谱填料
蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异 性的配基
第十章有机高分子基质HPLC填料
二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂
基质材料决定填料物理结构和化学结构:
颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构 形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接 影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。
三、填料性能评价
• 填料的物化性质指标 • 填料的色谱性能表征
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、物化性质指标:
a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度ρg(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、
溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度Ψ； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。
多糖型凝胶 高聚物树脂
➢基质微球——天然多 糖或合成单体或交联剂 ➢负载样品的能力强， 色谱容量高 ➢耐酸碱、具化学稳定 性，柱寿命长，易再生 ➢不易产生非特异性吸 附作用
无机基质
硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石
石墨化碳黑
第十章有机高分子基质HPLC填料
一、HPLC色谱柱的关键在于填料
• 物理结构→色谱动力学
第十章有机高分子基质HPLC填料
2.琼脂糖系:
① Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝 胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)
② 高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow
(Sepharose 6FF, Sepharose 4FF)
③ 高效琼脂糖凝胶Sepharose high Performance
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、色谱性能表征:
① 保留值：
保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)
② 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动
相及温度有关。
③ 柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。 ④ 填充柱的总空隙度和穿透性： ⑤ 分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰
与经典色谱的比较
色谱法 固定相粒度 柱长及内径 采用压力 分析速度 经典 大于 100μm 10-100cm φ2-5cm 常压 几十小时 高效 5－10μm 10-30cm φ1-5mm 107Pa 几分钟
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC分离填料：
有机基质
可分为:
多糖型 聚合物型
第十章有机高分子基质HPLC填料
（一）多糖型基质材料
1.葡聚糖系:
① 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小 而且分布范围窄（10~23µm）;
Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和
高效色谱 ② 烯丙基葡聚糖与N,N`-亚甲基双丙烯酰胺交联共
聚而成的凝胶。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属 于高效凝胶，较高流速下使用
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避
底宽度一半之和的比值。
第十章有机高分子基质HPLC填料
四、反相HPLC高分子填料
Reversed Phase Chromatography,RPC
反相色谱（原理参照P237） ：非极性
固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主， 特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。
① 特定的选择性; ② 良好的化学稳定性及热稳定性; ③ 避免不可逆吸附。
不同填料的化学结构是通过对基质材料的 化学改性而实现的。
第十Leabharlann Baidu有机高分子基质HPLC填料
离子交换色谱填料
颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强 弱阴阳离子集团。
反相色谱填料
C18、C8烷基等疏水性集团
正相色谱填料
以多糖凝胶为基质的产 品，颗粒都>20µm左右
以合成树脂为基 质的产品，颗粒 <7µm
同左
第十章有机高分子基质HPLC填料
目前的主要发展方向(研究热点):
① 颗粒单分散的填料; ② 贯穿性超大孔结构的填料; ③ 小颗粒的非多孔填料。
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求
Superdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速 Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶
第十章有机高分子基质HPLC填料
（二）聚合物型基质材料
• 交联聚苯乙烯树脂:
苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)， 是应用最为广泛的一类基质树脂。
• 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:
以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、 环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。
免复杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
第十章有机高分子基质HPLC填料
常见的液相色谱填料类型
多孔型
分：小孔（<10nm）、中 孔（10-30nm）、大孔 （>30nm）和超大孔 （>100nm），应用占主 导地位
非多孔型
整体颗粒无孔
薄壳型
颗粒表面层多 孔，内部无孔。
以合成树脂为基质的产 品，颗粒在10µm左右
分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作 参数选择广泛;
分离纯化+分析检测; 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监
测和自动化操作。
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC的关键设备
① 专用的高压输液系统; ② 高灵敏检测系统; ③ 高效分离柱
• 其中分离柱是色谱的中心, 是最为关键的部分
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章 有机高分子基质的高效液 相色谱分离柱填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
首先回顾几个问题
• HPLC方法的主要特点有那些？ • HPLC的主要设备分哪几部分？
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC方法的主要特点
分离效率高，选择性好，适于各种多元组 分复杂化合物的分离;
应用范围广：无机物—有机物，天然物质 —合成产物，小分子---大分子，一般化合 物到生物活性物质;
羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团
亲和色谱填料
蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异 性的配基
第十章有机高分子基质HPLC填料
二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂
基质材料决定填料物理结构和化学结构:
颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构 形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接 影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。