侧脑室注射Aβ25-35对学习记忆的影响

三、前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD），又称为老年性痴呆，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病。

AD起病缓慢，症状复杂，早期以视空间技能受损和近事记忆力障碍为主，随着病情的进一步发展，病人出现计算能力减退、认识障碍及语言障碍等。

据国际阿尔茨海默病协会（Alzheimer’s Disease In ternational，ADI）的“世界阿尔茨海默病2015年报告”，目前全球范围内一共约有4600万痴呆患者，这一数量将以每20年增加1倍的速度逐渐递增，平均每年新增痴呆病例可达990万[1]。

AD的病因和发病机制尚未完全阐明，其病因可能为家族遗传、环境因素影响、老龄化、头部外伤史等。

AD患者中枢神经系统内存在多种神经递质的异常，如乙酰胆碱、5-羟色胺、兴奋性氨基酸等，其中乙酰胆碱减少导致的胆碱能神经系统功能缺陷在AD疾病研究中尤为突出[2]，目前的治疗药物中应用得最多的也是胆碱能药物。

目前被美国FDA批准为治疗AD的药物只有5种：他克林（tacrine）、多奈哌齐（donepezil）、利斯的明（rivastigmine）、加兰他敏（galantamine）和美金刚（memantine）。

这些药物只能改善AD的早、中期症状，对AD晚期疗效较差，也不能阻断AD发病的病程。

因此，研发具有新治疗靶点与新作用途径的AD防治药物是目前研究的热点之一。

动物模型是研究AD的重要手段，AD动物模型可在实验动物身上模拟AD患者的行为异常如学习记忆能力损害等，为研究AD发病机制及试验和判断抗AD新药疗效提供试验对象。

国内外学者已在现有的AD发病学基础上建立了多种不同的AD样动物模型, 尽管这些动物模型存在一定的局限性, 不能全面模拟出AD的特征[3]，但都出现了动物学习记忆能力不同程度下降这一共同特点。

学习记忆功能障碍是AD患者最典型的特点。

学习与记忆是指获取新信息和新知识并对这些信息和知识进行保存和读出的神经过程，记忆可分为陈述性记忆和非陈述性记忆，信息经过大脑皮层加工处理可在海马和内侧颞叶部位形成陈述性记忆，并最终储存于大脑皮层区域[4]。

临床上健忘和痴呆的病人陈述性记忆首先受损。

探究AD发病原因，发现患者脑有萎缩，其中颞、顶及海马部位的萎缩最为明显；组织病理学法观察到患者海马、额颞叶等结构有大量神经元丢失。

这些萎缩、神经元丢失与学习记忆直接相关，是导致AD患者的记忆缺损的最主要原因。

因此学习与记忆能力障碍是AD样动物模型建立必不可少的指标。

在AD的发病学说中，β淀粉样蛋白级联反应学说受到广泛关注。

AD患者脑中最有代表性的病理特征为老年斑(senile plaques，SPs)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，β淀粉样蛋白（beta amyloid protein，Aβ）是构成AD淀粉样老年斑块的主要成分[5]。

Aβ级联反应学说认为，过量表达的Aβ在大脑皮质和海马神经元外沉积并缓慢形成老年斑，导致神经胶质细胞炎症反应、突触功能异常和大量神经细胞消失，引起脑萎缩、神经结构和功能严重破坏[6]。

脑内注射Aβ拟AD样动物模型也正是基于这一学说：将具有神经毒性作用的Aβ片段注射到动物脑组织，诱导动物产生AD样学习记忆障碍模拟AD的发病。

Aβ源自淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein，APP），APP可以被α，β，γ3种蛋白酶分解：经α-分泌酶途径剪切途径生成大量可溶性的sAPPα，降低细胞内Ca2+浓度，促进神经细胞发育，改善学习和记忆功能；经β-分泌酶、γ-分泌酶途径生成sAPPβ、AICD和Aβ片段[6]。

内源性Aβ片段是具有39~43个氨基酸的分子，最常见的片段为Aβ1-40和Aβ1-42，多以可溶性单体存在，是体内正常新陈代谢产生的物质。

以单体形式存在的Aβ片段不具有神经毒性，当平衡被打破、Aβ单体逐步形成寡聚体或凝聚态结构时，具有神经毒性。

Aβ25-35为Aβ蛋白体外水解得到的片段，体内并不存在，但其神经毒性与与内源性Aβ的全长片段几乎相等，且有研究证实Aβ聚合的关键位点与其毒性片段均位于Aβ中段，因此许多AD样模型选用Aβ25-35建立[7]。

实验时Aβ25-35单体需经老化聚集为不可溶状态使其增加毒性。

Aβ的注射部位可以是：第四脑室、基底核、海马、侧脑室、杏仁核、纹状体，注射方式多样，如一次性注射、微渗泵连续灌注、单侧注射、双侧注射等，均可诱导出AD样模型。

而对于AD样动物模型学习记忆评价的方法众多，其中较为常用的方法是Morris水迷宫（Morris Water Maze，MWM）。

经典Morris水迷宫测试程序主要包括定向航行（place navigation test）和空间探索（spatial probe test）两个部分。

其中定向航行试验是将小鼠从不同入水点放入水中，评价其游至固定隐藏平台位置的逃避潜伏期（escape latency），考察对平台空间位置的记忆；空间探索试验是指在经过多次定向航行训练后，撤去隐藏平台，根据小鼠的游泳路径探究其对原平台的记忆。

在训练过程中，小鼠可通过加工空间信息产生空间位置认知，从而形成一种空间参考记忆。

这种记忆主要依赖边缘系统及大脑皮层有关脑区储存，伴有Hebb突触修饰，属陈述性记忆，与筛选研究AD防治药物的要求相符，具有优势[9]。

本实验运用Morris水迷宫法来检测AD样动物模型的学习记忆能力。

基于上述情况，本论文拟以侧脑室一次性注射法及Morris水迷宫观察Aβ25-35对小鼠学习记忆的影响，为进一步研究药物对AD样动物模型的作用提供模型基础，为抗AD新药疗效的观察提供途径。

五、结果1. 侧脑室注射给药部位的验证以小鼠侧脑室一次性注射给药方法注射墨水，20min后处死小鼠，取出脑组织进行冠状切片，验证注射部位（如图3）。

验证结果提示给药部位准确。

图3 侧脑室注射给药部位验证2. 侧脑室注射Aβ25-35对小鼠Morris水迷宫学习记忆的影响2.1 Aβ25-35对小鼠上台潜伏期的影响在侧脑室注射Aβ25-35后的1、2、3、4、5周，采用Morris水迷宫定向航行试验检测各组小鼠学习记忆能力，每周连续3天，每天4次，分析各组小鼠每周第一天的潜伏期变化。

定向航行试验结果参见图3。

每组内单因素方差分析显示，模型组小鼠潜伏期随时间进行显著下降（F=4.295，P<0.05），对照组的潜伏期随时间进行亦显著下降（F=5.004，P<0.01）；组间两因素析因分析显示，模型组小鼠平均潜伏期较对照组显著延长（F=0.951，P<0.05）。

即随着定向航行训练次数的增加，两组小鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短，但两组之间差异显著，两组小鼠在第2、3、4、5周的潜伏期差异也具有显著意义(* P<0.05，** P<0.01)。

上述结果显示模型组小鼠学习记忆能力较对照组小鼠差。

图4 侧脑室注射Aβ25-35对小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响**2.2 Aβ25-35对小鼠搜索平台策略及路线的影响模型组和对照组的搜索目标策略和游泳路线也有差异。

在训练初期，两组小鼠搜索平台的策略均以随机式、边缘式为主，游泳路程长且轨迹多分布于水池壁（如图5）。

而随着训练次数增加，对照组多以趋向式搜索，偶有直线式，游泳路程较短，在短暂适应水中环境后很快找到隐藏的平台（图6 A）；模型组则仍以随机式、边缘式为主，游泳路线长而复杂（图6 B）。

图5 训练初期各组小鼠游泳轨迹示意图图6 训练后期各组小鼠游泳轨迹示意图六、讨论动物模型是研究AD的重要手段，目前AD的病因和发病机制尚未清楚，除了Aβ级联反应学说外，还有tau蛋白磷酸化异常学说、胆碱能学说、自由基损伤学说、炎症学说、基因异常调控学说等[10-13]。

侧脑室注射Aβ是常见的建立AD样动物模型的方法，研究表明，动物脑内注射Aβ可通过多渠道参与引起AD。

Aβ可破坏促进细胞凋亡因子Bax与抑制抗凋亡因子Bcl-2之间的动态平衡，直接诱导神经细胞凋亡[14]；可激活胶质细胞产生炎症物质，引起细胞氧化应激反应，进而损伤神经元[15]；还可抑制乙酰胆碱的合成，造成胆碱能神经传递障碍而影响认知功能[16]。

Aβ能够升高细胞内的Ca2+浓度，降低突触的可塑性，从而使细胞对氧化应激和兴奋性毒性的易感性增加；同时降低膜的流动性、影响神经传递过程[17]。

还有研究发现，Aβ可加速tau蛋白磷酸化，对神经元纤维缠结的产生有促进作用等[18]。

不同的Aβ片段(Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ25-35)均具有神经毒性。

本实验采用侧脑室一次性注射Aβ25-35片段的方法模拟小鼠AD样学习记忆障碍。

在众多Aβ25-35拟AD样动物模型的研究中发现，大鼠及小鼠的学习与记忆能力在侧脑室一次性注射Aβ25-35后发生了明显缺损，结果可在Morris水迷宫实验、跳台实验、Y迷宫实验等行为学检测中明显体现。

同时研究发现，侧脑室一次性注射Aβ25-35还可以引起动物神经元退化、胶质细胞活化、乙酰胆碱酯酶活性下降等反应[19,20]。

因此，侧脑室一次性注射Aβ25-35可以产生与AD症状平行的学习记忆障碍、神经元损伤，方法较为成熟有效。

本实验主要是对Aβ25-35拟AD样动物模型学习记忆能力障碍的初步探索，为建立可靠、重现性好的AD样动物模型及进一步探究药物对AD的作用奠定基础。

通过结果（图4）可发现，在手术后2周，模型组与对照组的学习记忆出现了显著差异，4周之后显著性更高，即模型组小鼠可能在2周时病症明显，4周后加剧。

据此可以推断，侧脑室一次性注射Aβ25-35对小鼠的学习与记忆能力有抑制作用。

上述结果也提示我们，在今后Aβ25-35拟AD样动物模型的建立中，将针对学习记忆能力的行为学实验设计在手术2周后会使结果更具有代表性；同时可以预测，在2周时取材，脑部组织应出现相应的病理特征，4周后特征更为显著；并且，在研究药物对此动物模型的影响时，手术前或手术后2周内给予预防手段应有效，而治疗药应尽量在4周前给予，以防止动物出现不可逆性的病变。

本实验只对学习记忆能力进行检测，还不足以确定Aβ25-35拟AD样动物模型的成功。

要建立成熟、稳定的AD样动物模型还需其他不同的指标：运用其他行为学方法检测AD样动物的学习记忆能力水平，如避暗实验、Y迷宫实验等；运用组织学方法鉴定模型动物病理特征，如采用染色技术观察小鼠海马等脑组织中是否出现老年斑和神经原纤维缠结。

此外，由于本实验只进行至第5周，只能在学习记忆变化的基础上初步推测模型动物AD样病程，要确定模型动物具体的病程进展还应有更全面的学习与记忆行为学检测证据，同时还需要病理组织学等方面的佐证。