HIVELISA法抗体检测细则

HIV(ELISA法抗体检测细则

1. 目的

根据《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版），对艾滋病病毒抗体检测作必要的细化和补充，以规范本实验室对艾滋病病毒抗体的检测方法。

2. 适用范围

本检测细则适用于对人体血液中艾滋病病毒抗体检测。

3. 职责

3.1 检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测；

3.2 复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；

3.3 科室负责人：负责对科室综合管理和检测报告的签发。

4. 检测依据

GB16000－1995艾滋病诊断标准及处理原则。

5. 方法原理

在微孔板上预包被高纯度基因重组HIV(1+2)型抗原，可与样品中抗HIV抗体反应，同时加入HRP标记HIV(1+2)型抗原，然后用TMB底物作用显色，加入终止液终止反应，有颜色变化的微孔板变为黄色，颜色的深浅与血清中HIV抗体含量呈正比，通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定样品中HIV抗体的存在与否。

6. 检测仪器设备名称、型号和材料

6.1美国宝特ELX800型酶标仪；

6.2 水浴箱37℃±1℃；

6.3 (新鲜的)蒸馏水或去离子水；

6.4 容量器(用于准备洗涤液)；

6.5 一次性隔离衣、手套、帽子、鞋套。

6.6 计时器；

6.7 84消毒液、75%乙醇；

6.8 适用于盛装有可能受污染的物品的容器；

6.9 吸水纸；

6.10 微板振荡器（用于溶解及混匀结合物与样品，速度约为900r/min）；

6.11 KHB ST-36W洗板机；

6.12 加样器(20～100μL)，准确度±2%及一次性加样头。

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7. 检测环境条件

所有的实验应20℃～25℃室温中进行

8. 检测步骤

8.1 检测前准备

8.1.1 样品收集和准备

a. 不需要特殊准备，不需要病人禁食；

b. 血清和血浆都可使用，柠檬酸，肝素和EDTA等抗凝剂不会产生影响，但不能

与其他药物并用；

c. 血液应以一般法收集，并要小心处理；

d. 自血清中去除纤维蛋白，自血浆中去除红血球，避免溶血；

e. 标本中若含氮化钠或微粒物质会产生错误结果；

f. 高胆红素血、高溶血、乳糜血或高蛋白血标本通常会影响实验结果；

g. 标本中应无微生物，在2℃～8℃温度下，可保存一周，新鲜血液标本可长期保存在-20℃，标本要避免反复冻融；

h. 经一个冷冻/融化周期处理或在56℃30分钟的热灭活标本不会影响实验结果；

i. 标本上应有与其它标本分开产，并有明显标记(如HIV检测、姓名、编号或时间)。

8.1.2 检测试剂：本实验室采用珠海丽珠和英科新创两种人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型艾滋病病毒抗体酶联免疫检测试剂(双抗原夹心法)

珠海丽珠英科新创

a. 微量酶标板12×8孔；微量酶标板12×8孔

b. 1瓶HIV阳性对照（1ml）， 1瓶HIV阳性对照（1ml）

c. 1瓶HIV阴性对照（1ml）； 1瓶HIV阴性对照（1ml）

d. 1瓶(50mL/瓶)浓缩洗涤液(20×)； 2瓶(25mL/瓶)浓缩洗涤液(20×)

e. 显色剂A、B液(7mL各1瓶；显色剂A、B液(7mL各1瓶；

f. 1瓶HIV终止液(7mL/瓶)； 1瓶HIV终止液(7mL/瓶)

g. 1个自封袋； 1个自封袋

h. 2张封板膜。 2张封板膜

8.2 检测步骤

8.2.1 将标本、试剂和需要数量的微孔放置室温平衡(约15至30分钟)；

8.2.2 配液：将浓缩洗涤液(25×) 用蒸馏水或去离子水稀释至使用量备用；

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8.2.3 编号：将样品对应微孔按序编号，每板设空白孔1孔、阴性对照3孔、阳性对照2孔；

8.2.4 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照50μL、空白孔不加任何物；

8.2.5 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

8.2.6 洗涤：小心将封板膜揭掉，至洗板机上洗涤6遍；

8.2.7加酶：除空白孔外，其余孔加酶标记物50ul（英科新创试剂则加100ul）8.2.8温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

8.2.9洗涤：小心将封板膜揭掉，至洗板机上洗涤6遍

8.2.8 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板

后置37℃避光显色30分钟；（英科新创试剂则20分钟）；

8.2.9 测定：每孔加终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长于450nm处

(建议用双波长检测，参比波长630nm)，使用广州华鑫HSELx80x酶联免

疫检验分析系统操纵美国宝特ELX800酶标仪测定各孔OD值，和计算

CUTOFF值。

8.3 操作注意事项

8.3.1 待检标本和试剂盒(含有人血成分)及废弃物有潜在传染性，应严格遵守消

毒隔离制度；

8.3.2 不要用嘴吸吸管；

8.3.3 实验操作后应立即去除手套，用清洁液洗手；

8.3.4 避免标本溅出，污染环境；

8.3.5 避免皮肤粘膜接触H

2SO

4

，如接触到这些试剂应立即用水冲洗；

8.3.6 每次实验完毕，必须作一次性严格消毒；

8.3.7 不能使用过期试剂

8.3.8 试剂必须保存在2℃～8℃环境中；

8.3.9 不同批号试剂不能混用，不得使用其它公司的洗液

8.3.10 封板膜不能重复使用；

8.3.11 加液器应经常校正；

8.3.12 加样时要小心，不要使吸头碰着酶标板孔上的包被抗原或抗体层；

8.3.13 洗板完毕应将板扣干，扣板应使用一次性吸水纸，不得重复使用，吸水

纸应保持干燥；

8.3.14 标本、试剂和微孔条在使用前应放室温(20℃～25℃)平衡15～30min，

未用完的微孔用自封袋密封保存；

8.3.15 严格按说明书的时间操作，避光显色后立即加入终止液，并立刻测量OD 值。

9. 检测记录和数据处理

9.1 使用广州华鑫公司HSElx酶联免疫检验分析系统可以直接操纵ELX800酶标仪，直接进行OD值读数并进行自动计算分析实验结果；

9.2 计算： NC=阴性对照平均的OD值，PC=阳性对照平均的OD值；

9.3 阴性对照的正常范围：正常情况下，NC必须≤0.12，

9.4 阳性对照的正常范围：正常情况下，PC必须≥0.80，

9.5 确定NC的均值；

9.6 确定PC的均值；

9.8 临界值(CUTOFF)计算：丽珠试剂临界值=NC的均值+0.15。英科新创试剂临界值=NC的均值+0.10

10. 结果判断

10.1 样品OD值≥CUTOFF值者为阳性，样品OD< CUTOFF值者为阴性；

10.2 结果为阳性或不确定样本，使用两种试剂再次进行对比试验。

10.3 如果两种试剂对比试验仍呈阳性反应或不确定，应送HIV确认实验室进行确认。

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