胰岛素生产流程图ppt课件

氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin
WFI透析至盐 酸胍浓度为 20%w/w
pH 9-11，50%w/w(6M)盐 酸胍，0.35%碳酸氢铵， 3%硫酸钠，1.5%过硫酸钠， 反应时间12小时，收率95%
WFI-2
S -1 2 7 Guan HCl
会产生少 量有毒氰 化物气体， 现场应S-1准11 备次氯酸
包涵体含量：干重的20%
. 终保温：10度
9
初回收工段—物料温度保持10度
--三个平行的碟片
式离心机收获菌体
--菌液从37000L浓
缩到9165L菌泥
--菌体收率98%
EDT A Solution S -1 3 8
三次高压匀 Primar浆y R机ec破ov菌ery释Section
放包涵体 压降800bar L iq W a s te 2
S -1 1 5
S -1 1 4
Dead-End FiltratioLniq Waste 4 P-16 / DF-101
Liq Waste 5
Diafiltration
过滤去除细小颗 粒，保护后续层 析柱。
终体积5200L
WFI透析6小时， 收率98%， 去除尿素和 2-巯基乙醇
.
P-8 / V-103
Hom ogenization Blending / Storage
S -1 1 8
P-13 / DS-101
Centrifugation
P-10 / V-110
Blending / Storage
S -1 0 9 W F I-1
M rET OH/Urea
S -1 3 0 L iq W a s te 3
加2倍体积的清洗剂 (0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体
10
反应工段—溶解包涵体
包涵体内Trp-LE’-Met-proinsulin 含量 ：80% w/w
反应时间：8小时 溶解收率：95%
W F I-1
S -1 3 0 L iq W a s te 3
S -1 3 2
P-17 / DE-101
S-135
S -1 3 6
WFI-3
P-15 / V-103
CNBr Cleavage
S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8
S -1 4 9
S -1 2 3
S -1 5 2
S -1 2 1
P-17 / DE-101
Dead-End FiltratioLniq Waste 4 P-16 / DF-101
化
.
4
E.Coli胰岛素原法 转化流程
.
5
市场分析和设计基础（2005）
糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增 长率3-4%
胰岛素年销售额35-40亿美元, 由Novo Nordisc、Eli Lilly和Sanofi Aventis三家垄断
每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750 每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素 对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素 目前年产量20-30吨纯胰岛素
S-108 P-6 / AF-102
W a te r
S -1 0 7
Air Filtration
P-1 / V-101
Mixing
P-2 / ST-101 S -1 0 6
Heat Sterilization
S -1 0 1
A m m o n ia
P-5 / AF-101
Air Filtration
盐
反应时间：12小时 反应温度：20度 利用前面溶解反应釜
CNBr/HCOOH
Liq Waste 6
共用前面 包涵体溶 解过程的 透析器
P-21 / DF-101
Diafiltration
P-18 / CSP-101 S -1 1 7
S -1 2 9
S-128 Rotary Evaporator
P-15 / V-103
S -1 5 7
L iq W a s te 1 6
P-33 / DF-104 L iq W a s t e 1 5
Diafiltration
L iq W a s te 1 4
P-31 / C-105
P-29 / DF-1L0i3q W a s t e 1 3
Diafiltration
P-28 / C-104
Diafiltration
P-25 / C-103
S-Sepharos e
.
14
终纯化工段
Final Purification Section
S -1 7 3
S -1 7 4
S -1 7 5
W F I-6
S -1 6 5 S -1 6 6 S -1 6 7
W F I-5
S -1 7 2
L iq W a s te 1 4
设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人
年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次
每批次发酵液体积：37.5立方米，
发酵罐空罐体积：50立方. 米
6
人重组胰岛素（E.coli）生产流程
发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段
.
7
Media
W a te r
S -1 0 2
IB Solubilization
玻璃反应釜内加终浓度 为300g/L(5M)的尿素 （溶解变性蛋白）和 40g/L的 2-巯基乙醇 （减少二硫键的结合）
P-14 / DS-101
Centrifugation
再次离心， 去除菌体碎 片和可溶性 蛋白 共用前面回 收工段的碟
11
片离心机
反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个
P-13 / DS-101
Centrifugation
P-10 / V-110
Blending / Storage
加与菌泥等体积的缓冲液 (96.4%w/w WFI注射用水, 0.7%EDTA, 和2.9% TRISbase)稀释,有利于菌体碎片 与包涵体分离
.
用前面的碟片 式离心机回收 包涵体收率 98%
L iq W a s te 1 2
P-30 / DF-103
Diafiltration
P-34 / BCF-101
Basket Centrifugation
P-12 / V-111
Crystallization
Gel Filtration
.
RP-HPLC
8
Media
S -1 0 2
发酵工段
Fermentation Section
反应工段—再折叠
S-135
S -1 3 6 S -1 2 3
Reactions加S入ec巯tio基n 乙醇 WFI-3
S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8 S -1 4 9
S -1 5 2
S -1 1 9 S -1 4 4
Liq Waste 7
S -1 4 1
pH4 收率90%
P-36 / C-101
Liq Waste 5
Diafiltration
S -1 1 5
S -1 5 0
E n zym e s
S -1 5 1
WFI-4
S -1 5 3
S -1 1 4
P-8 / V-103
IB Solubilization
P-14 / DS-101
Centrifugation
S -1 5 8 S -1 5 9 S -1 6 0
胰岛素(E.Coli)生产流程
.
1
.
2
人胰岛素—碳水化合物代谢和体细胞供能
一级结构：51个氨基酸 双链（A：21，B：30） 分子量：5734 g/mol 等电点：5.4
胰岛素产生
受损导致糖
尿病
.
3
人胰岛素的制备方法
人胰腺提取---原料来源有限
通过单个氨基酸化学合成---生产成本太高
猪胰岛素转化或“半合成”--成本高，来源少
P-20 / V-105
CNBr Cleavage
Sulfitolys is
在CNBr沸点
35度旋转真 亚硫酸分解的目的是打 空蒸发1小时
开胰岛素原和二硫键， 给半胱氨酸加上SO.3部分
70%甲酸溶液 30倍过量加入CNBr
(理论摩尔比1:1) 收率95% 12
三个平行阳离子交 换层析床纯化
proinsulin
Diafiltration
Liq Waste 9
P-22 / C-102
HIC Column
S -1 2 6
S -1 6 2
P-26 / V-108
P-27 / DF-102L iq W a s t e 1 0
Diafiltration
P-25 / C-103
S-Sepharos e
Enzyme Conversion
S -1 5 6
S-154
L iq W a s te 1 1
S -1 1 9 S -1 4 4
Liq Waste 7
S -1 4 1
P-36 / C-101
S-Sepharos e
MrEtOH P-23 / V-107
Refolding
S -1 8 6
S -1 3 7
P-24 / DF-102 Liq Waste 8
Mixing
P-2 / ST -101 S -1 0 6
Heat Sterilization
S -1 0 1
A m m o n ia
A ir
S-110 P-3 / MX-101
Mixing
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
P-5 / AF-101
Air Filtration
T ri to n-X-100
终物料体积： 1400L
S -1 2 5
L iq w a s t e 1
P-9 / DS-101
Centrifugation
S -1 4 2
P-38 / V-109
Blending / Storage
P-11 / HG-101
Hom ogenization
S -1 1 8
P-7 / V-102
Fermentation
S-127 Guan HCl
S-104
L iq w a s t e 1
P-19 / V-106
Storage
P-9 / DS-101
Centrifugation
S-111
CNBr/HCOOH
S -1 4 2
P-11 / HG-101 P-38 / V-109
再折叠的目的是去除 SO3，然后使二硫键形 成，并再折叠成胰岛 素原的正确天然结. 构
13
反应工段—酶转化
S -1 5 1
WFI-4
E n zym e s
S -1 5 3
P-26 / V-108
Enzyme Conversion
S -1 5 6
S-154
L iq W a s t e 1 1
P-27 / DF-102L iq W a s t e 1 0
P-7 / V-102
P-19 / V-106
通气量： 0.5VVM
S-110 P-3 / MX-101
Mixing
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
Fermentation
Storage
空罐体积：50立方米
前接2级种子罐
发酵周期：18小时
发酵温度：37度
终菌密度：30克（干重）/升
S -1 4 3
WFI-2
S -1 3 2
P-18 / CSP-101 S -1 1 7
S -1 2 9
S-128 Rotary Evaporator
P-21 / DF-101
Liq Waste 6 Diafiltration
P-20 / V-105
Sulfitolys is
Reactions Section
S-Sepharos e
MrEtOH P-23 / V-107
Refolding
P-24 / DF-102 Liq Waste 8
Diafiltration
Liq Waste 9
P-22 / C-102
HIC Column
床直径：140cm 床高度：25cm 填料：SP Sepharose FF,
GE 洗脱液：29% w/w尿素，
P-31 / C-105
基因工程菌发酵
--双链—Genentech,开发，Eli Lilly 放大
--胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体）
--分泌法（Yeast），Novo Nordisk产业化
--细胞内法百度文库E.coli），表达121+82个氨基酸
的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵体，Eli Lilly 产业
Fermentation Section
S -1 0 7
S-108 P-6 / AF-102
Air Filtration
Primary Recovery Section
EDT A Solution S -1 3 8
L iq W a s t e 2 T riton-X-100
S -1 2 5
P-1 / V-101
Final Purification Section
S -1 7 3
S -1 7 4
S -1 7 5
W F I-6
S -1 6 5 S -1 6 6 S -1 6 7
S -1 6 1 W F I-5
S -1 2 4
S -1 7 2
Product
P-35 / FDR-101
Freeze Drying
Liq Waste 17