黄酮标准曲线绘制的实验报告

黄酮标准曲线绘制的实验报告

1.总黄酮的测定

1.1 实验仪器

电子天平AR2140;

紫外可见分光光度计UV2754;

型数控超声波清洗器KQ3200DB;

超级恒温槽;

Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;

FD21C250 冷冻干燥机2

1.2 试剂及药品

芦丁标准品

硝酸铝国产分析纯（配成5 %）

亚硝酸钠国产分析纯（配成10 %）

氢氧化钠国产分析纯配成（配成1mol/L）

95%乙醇，无水乙醇国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）

Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）

没食子酸对照品：基准纯。

大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔

1.3实验步骤：

及波长的确定

样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在

波长为510nm处吸收值最大。

精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。

及绘制标准曲线

精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。（以试剂空白做参比）

以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

序号浓度（ug/ml）吸光度

1 0 0

2 15 0.180

3 30 0.349

4 4

5 0.546

5 60 0.727

6 75 0.884

7 90 1.063

表1-1：芦丁标准曲线测定数据

图1-2：芦丁标准曲线

根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。取黄酮提取液，取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml 的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液

4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。

样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)

式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。）

n—稀释倍数，量纲为1;

V

—样液总体积，mL;

I

V—测定时取样体积，mL;

W—样品质量，g。

2.总分含量的测定

2.1 实验仪器

ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;

DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;

容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL);

烧杯、移液管、吸耳球。

2.2试剂及药品

没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真

空中干燥4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2.3 Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量

3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制

称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的

磷酸溶液和20 ml 浓盐酸，文火回流10 h ，然后加入3 g 硫酸锂及15 ml 双

氧水，加热沸腾15 min 至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 ml 容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

准确称取15．00 mg 干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml ，制成0.3mg/mL 没食子酸的溶液，作为对照品溶液。

将0.3mg/mL 的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL ，0.03mg/mL ，0.06mg/mL ，0.09mg/mL ，0.12mg/mL ，0.15mg/mL 、0.18mg/mL 、0.21mg/mL 的溶液，分别取1mL 置于10mL 的容量瓶中，加入2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h (Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm 波长处测定吸光度值。 2.3.3标准曲线的制备

以吸光度A 为纵坐标,浓度c 为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c 与A 的线性回归方程以及相关系数R 2。

表3-1：没食子酸标准曲线测定数据

图3-1：没食子酸标准曲线 取提液2ml 至

10ml 的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml 四份,分别置于10mL 比色管中，加入2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶

液．混匀，以蒸馏水

稀释至刻度。振荡一下，静置2h 。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm 波长处测定吸光度值。 总酚酸含量计算：

序号

浓度

（ug/ml ） 吸光度（WL765.0）

1

3 0.132 2

6 0.284 3

9 0.411 4

12 0.582 5

15 0.712 6

18 0.843 7 21

1.013