基因敲除-简介

WT
glrA
T1
PCR1
T1
PCR2
P
hph
1.9 kb LB 2.5 kb
2.9 kb
RB
pAg-DGR
PCR验证∆glrA菌株
Ladder
∆glrA ∆glrA
cglrA
cglrA
WT
WT
NC
PCR 2 (2.89 kb)
pMB-GR3.9
cglrA
NC
Ladder
230 bp 75
∆glrA
hph
用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋来自百度文库质催化，如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
基因敲除技术简介
龙良鲲
定义:
在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使 其功能完全丧失的实验技术。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动
植物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和 空间的基因敲除。
基因敲除原理
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。 高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转 移、农杆菌介导的转化）。
Thanks!
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体（最好带有双标记）。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 kb)
∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1
除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成 功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上， 成为重组载体。
基本步骤