微生物金黄色葡萄球菌
食品微生物学检验金黄色葡萄球菌
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血浆凝固酶实验
血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别接种到5 mLBHI和营养琼脂小斜面，36 ±1℃培养18 h～24 h 。 取新鲜配置兔血浆0.5 mL ，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL～0.3mL ，振荡摇匀，置 36 ±1℃温箱或水浴箱内。 每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置 时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为 对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36±1℃培 养18 h～48h ，重复试验。
第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计 数
结果
列出完成实验所使用的所有步骤。 切记要为步骤加编号。 添加实验照片。
第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释 培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优 势，但却具有特殊生理功能的类群 其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆 脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断 该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生 物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫 化和反硫化细菌等。）的数量和检测污水、牛奶及其他食品 中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进 行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因 不能使用平板计数时才采用。 MPN法原理与局限C:\Users\华侃\Desktop\MPN法的原理与局 限性分析.pdf
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌1 简述金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界，空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及与外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。
本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。
本菌抵抗力较强，干燥情况下能生存数月，80℃30min的条件下尚能存活，5%石炭酸或0.1%升汞溶液10～15min才会被杀死。
金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色、镜检和血浆凝固酶试验等步骤进行。
本法使用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。
2 仪器、设备及用具（见大肠埃希菌2）。
3 试液、指示液3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2无菌磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.5]。
3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。
3.3 革兰染色液[附录2.4，2.10，2.16]。
3.4 无菌枸橼酸纳氯化钠溶液[附录2.7]。
3.5 血浆的制备以无菌注射器吸取灭菌的5%枸橼酸纳的0.9%的氯化钠溶液1ml，用无菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml，轻轻混匀数分钟。
待血液不凝固时，徐徐放入灭菌离心管中，及时离心（500r/min离心5min0，分离血浆，用灭菌吸管将血浆转移至灭菌试管中，置冰箱备用。
临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌（如金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]测试，证明血浆合格后，方可用于试验。
3.6 1%酚磺酞指示液[附录4.4]。
4 培养基4.1 营养肉汤培养基[附录5.1]。
4.2 营养琼脂培养基[附录5.2]。
4.3 亚碲酸盐肉汤培养基[附录5.15]。
4.4 卵黄氯化钠琼脂培养基[附录5.16]。
4.5 甘露醇氯化钠琼脂培养基[附录5.17]。
5 对照用菌液取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，36℃±1℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1:106，加入含10～100cfu的对照菌菌液（一般用量为1:1060.1ml），同时用营养琼脂平板计数。
金黄色葡萄球菌的检查
金黄色葡萄球菌的检查同学们，这一节我们一起来学习一下第四章微生物限度检查法中的金黄色葡萄球菌的检查。
金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。
本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤。
看，这就是金黄色葡萄球菌，它是一种革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。
该菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，可经皮肤、粘膜侵入人体引起化脓性病变等局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。
所以，国家规定外用药品和一般滴眼剂、眼膏剂、软膏剂等规定不得检出金黄色葡萄球菌，检验金黄色葡萄球菌有重要意义。
金黄色葡萄球菌的操作流程如图所示，与之前讲述过的其他控制菌的检查一样：在完成培养基的配制和供试品的处理后，用营养肉汤于30～35℃增菌培养18～24小时，必要时可延至48小时。
增菌培养的目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。
接着，进行分离纯化，其目的是使被检菌从混合菌中分离出来。
以接种环沾取以接种环沾取1～2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30～35℃培养24～72小时。
当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。
若供试品分离平板生长的菌落与表中所列特征相似疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别接种于营养琼脂斜面上，于30～35℃培养18～24小时，取其培养物做以下检查。
1. 革兰染色镜检革兰染色镜检观察显微镜下的细菌结构是否符合金黄色葡萄球菌的形态特征：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，无荚膜。
排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列，菌体较小。
2. 血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能将血浆里的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血浆凝固。
检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固状，若试验管液血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性；否则为阴性。
食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验
免疫学方法
抗原制备
从金黄色葡萄球菌中提取特异性抗原，制备 成免疫原。
抗体制备
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过凝集 反应、沉淀反应等方法检测样品中的金黄色
葡萄球菌。
抗原抗体反应
将免疫原注射到动物体内，刺激机体产生特 异性抗体。
结果判定
根据反应结果判断样品中是否含有金黄色葡 萄球菌。
分子生物学方法
食品中微生物的检测-金黄 色葡萄球菌检验
目录
• 引言 • 金黄色葡萄球菌概述 • 样品采集与处理 • 微生物学检测方法 • 理化检测方法 • 结果分析与报告 • 质量控制与实验室安全
01
引言
目的和背景
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是一种常见的食品污染源，可引起食物中毒，对公众健康构成威胁。因此，检测食品中的金黄 色葡萄球菌对于保障食品安全具有重要意义。
适量性
根据检测方法和目的，采 集适量样品，以满足检测 需求。
样品保存与运
低温保存
样品应尽快放入低温环境 （如4℃冰箱）中保存，以 减缓微生物的生长速度。
避免反复冻融
尽量避免样品在保存过程 中反复冻融，以免影响微 生物的存活和检测结果的 准确性。
快速运输
样品在运输过程中应保持 低温，并尽快送达实验室 进行检测。
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微生物学检测方法
传统培养法
增菌培养
将液体样品接种到选择性增菌液 中，于适宜温度下培养一定时间 ，使金黄色葡萄球菌得以增殖。
鉴定
通过观察菌落形态、革兰氏染色 、血浆凝固酶试验等生化特征进 行鉴定。
01
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样品处理
取适量食品样品，进行均质化处 理，得到均匀一致的液体样品。
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金黄色葡萄球菌(牛肉膏蛋白胨培养基)
金黄色葡萄球菌（牛肉膏蛋白胨培养基）一、生物学特性典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 ^m左右，显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37。
C，最适生长pH7.4。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15% NaCI肉汤中生长。
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。
甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。
许多菌株可分解精氨酸，水解尿素, 还原硝酸盐，液化明胶。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。
二•流行病学金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。
因而，食品受其污染的机会很多。
近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。
金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占4 5% ,我国每年发生的此类中毒事件也非常多。
金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。
此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。
上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83% ,所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。
一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。
肠毒素形成条件：存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。
食品“金黄色葡萄球菌”致病解读
对检出金黄色葡萄球菌肠毒素的中毒食品，或经流行病学调查证实的中毒食品，立即进行无害化处理或销毁。对已售出或在市场流通的中毒食品，要立即召回，并进行无害化处理或销毁。
同时，提醒消费者一旦发生疑似金黄色葡萄球菌肠毒素中毒，除立即将患者送往医院进行救治外，还要立即停止食用并封存可疑食品。
3. 冷却加工的食品要快速降温到5℃以下;
4. 对已感染或携带某种病原体，并已造成食物污染或可能经食品引起疾病传播的食品加工人员，应依据有关法律法规，限制其从事食品加工活动。
5. 生产加工乳制品、肉类等高危食品的企业，应认真、严格的执行食品安全国家标准的相关规定。在加工过程中或在市场流通中发现产品检验的某些指标不符合食品安全国家标准，应以消费者利益为重，自觉把控出厂产品的质量、主动召回不合格产品，防范引起中毒事件的潜在风险。
实验室认可成功与否是标志着实验室是否达到国际水平，北京爱格森信息咨询从事行业领域数十年，将认可繁琐的步骤一一缕清，协助大大小小的实验室通过认可，对提高各个实验室的能力和国际水平有着重要帮助！
何为金黄色葡萄球菌?
Байду номын сангаас
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，其繁殖过程中产生的肠毒素是引发食物中毒的致病因子。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口;空气、污水等环境中也无处不在。
金黄色葡萄球菌致病因子
金黄色葡萄球菌本身不会对人体健康产生危害，但其繁殖过程中产生的肠毒素是主要的致病因子。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素具有极强的耐热性，在100℃加热条件下仍能存活30分钟不失去其活性，可存在于已经煮熟的食物中，导致食物中毒。食用金黄色葡萄球菌污染的食物是否会对人体产生危害，主要取决于污染食物中肠毒素的残留量。肠毒素对人体的中毒剂量存在明显的人群差异，一般认为是20～25μg。一般情况下，人体摄入带有达到致病量肠毒素的食物2~6小时后，出现恶心、呕吐和腹泻、腹痛、绞痛等急性胃肠炎症状，无发热，没有传染性，中毒症状通常会持续1~2天，轻度患者可以自愈，较严重者经治疗后可以较快恢复，愈后一般良好。但儿童对肠毒素比成人敏感，发病率高、病情重，需特别关注。
金黄色葡萄球菌检验实验原理
金黄色葡萄球菌检验实验原理
金黄色葡萄球菌检验是一种常见的微生物检验方法，用于检测环境中是否存在金黄色葡萄球菌。
实验原理：
1.准备好检测环境样品。
2.将样品加入培养基中，培养基中含有可抑制其他细菌生长的
物质。
3.将培养基移植到培养皿中，利用平板法悬浮液平铺在培养皿
表面。
4.将培养皿置于孵箱中，设定适当的温度和时间，有利于金黄
色葡萄球菌的生长。
5.观察培养皿上是否有金黄色菌落的出现。
6.对金黄色菌落的特征进行仔细观察，如菌落的形状、颜色等。
7.进行进一步的鉴定确认，通过其他实验方法验证金黄色菌落
是否为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检验实验原理简单易懂，能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的存在与否。
金黄色葡萄球菌护理
患者康复情况
感染控制：金黄色 葡萄球菌感染的控 制情况
症状缓解：患者症 状的缓解程度
康复时间：患者康 复所需的时间
并发症发生率：患 者康复过程中并发 症的发生情况
1
2
3
4
护理质量评价
护理效果评估：评估护
01
理措施对金黄色葡萄球
菌感染的治疗效果
护理质量指标：包括感
04
加强营养支持： 保证患者摄入足 够的营养和水分， 增强抵抗力
03
合理使用抗生素： 根据病情和药敏 试验结果选择合
适的抗生素
护理效果评估
感染控制情况
感染率降低：金黄 色葡萄球菌感染的 发生率降低
患者康复速度加快： 患者康复速度加快， 缩短住院时间
抗生素使用减少： 抗生素使用量减少， 降低耐药性风险
金黄色葡萄球菌护理
刀客特万
目录
01. 金 黄 色 葡 萄 球 菌 简 介
02. 护 理 策 略 与 方 法
03. 护 理 效 果 评 估
金黄色葡萄球菌简介
微生物分类
属于革 兰氏阳
性菌
属于葡 萄球菌
属
常见于皮 肤、呼吸 道、消化 道等部位
具有较强 的耐药性， 容易引起
感染
生长环境
02
适宜生长温度： 37℃
治疗方案
抗生素治疗：选择敏感抗生 素，如青霉素、头孢类等
A
营养支持：补充营养，提高 免疫力
C
B
局部护理：保持伤口清洁， 避免感染扩散
D
观察病情：密切观察病情变 化，及时调整治疗方案
护理操作要点
保持清洁卫生： 勤洗手、勤换衣、 勤消毒
微生物检测技术-金黄色葡萄球菌检测
国内检测标准
GB 4789.10-2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
GB/T 20944.32008
食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素的测定 第3部分：黄曲霉毒素 M1的测定
GB/T 23511.42008
食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定 第4部分：脱氢乙酸含量的 测定
样品中的快速检测。
纳米技术
纳米材料如纳米金、纳米孔等在 金黄色葡萄球菌检测中展现出巨 大潜力，具有高灵敏度、低检测
限和快速响应等优点。
未来研究方向
开发更高效、特异性的检测方法
01
针对金黄色葡萄球菌的不同表型和基因型，开发更高效、特异
性的检测方法，提高检测的准确性和可靠性。
集成化与自动化
02
将多种检测方法集成于一体，实现金黄色葡萄球菌的自动化检
治疗方案的选择。同时，对于流行病学调查和疾病监测也具有重要意义。
05
CATALOGUE
金黄色葡萄球菌检测技术展望
新技术发展与应用
基因组学技术
利用全基因组测序技术，能够快 速准确地检测金黄色葡萄球菌，
并识别其耐药性和毒力基因。
生物传感器技术
生物传感器能够实时、快速地检 测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏 度和特异性，适用于食品和环境
测，提高检测效率，降低人工误差。
多重耐药性研究
03
深入研究金黄色葡萄球菌的多重耐药性机制，为遏制耐药性的
传播提供科学依据和技术支持。
对公共卫生的影响与意义
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，通过改进检测技 术，能够及时发现和控制食品中的污染，保障公众的食品 安全。
预防疾病传播
金黄色葡萄球菌简介
金黄色葡萄球菌【微生物特征】金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）菌隶属于萄球菌属，为凝固酶阳性葡萄球菌，革兰染色阳性，呈单、双、短链或不规则葡萄串样排列（图1A，XXX倍下电镜照片）。
在血琼脂平板上菌落通常呈金黄色（图1B，37℃条件下平板培养几天），周围有明显的β溶血环（图1C）。
C图1. 金黄色葡萄球菌图1-1-1 A: 金黄色葡萄球菌。
B：血琼脂平板培养菌落照片；C：血琼脂平板培养菌落的β溶血环【临床意义】金黄色葡萄球菌主要寄生在人鼻腔，尤其是鼻前庭后部，是一种重要的机会性病原菌，其引起的人类疾病主要包括化脓性和毒素性两种类型：1.化脓性感染以脓肿形成为主，多数发生在皮肤组织，可表现为毛囊炎、疖、痈、伤口化脓以及脓肿等。
也可以引起深部脏器的脓肿或化脓性感染，如气管炎、肺炎、脓胸、中耳炎、骨髓炎等。
若皮肤原发化脓灶受到外力挤压或机体抵抗力下降，则会引起败血症，脓毒血症等；2.金黄色葡萄球菌产生外毒素可引起人体毒素性疾病。
如果摄入产生肠毒素的金黄色葡萄球菌污染的食物后，可造成急性胃肠炎的症状，即食物中毒。
其他还可引起烫伤样皮肤综合征以及毒性休克综合征，若不及时治疗病死率均较高。
【常见感染部位】皮肤、软组织、骨骼肌肉系统等。
【药物敏感性】“CHINET中国细菌耐药监测网”2021数据显示：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的检出率为30%，该菌对青霉素、左氧氟沙星、克林霉素的耐药率为92.2%、14.2% 和32.6%，未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌。
【主要耐药机制】耐甲氧西林金黄色葡萄球（MRSA），因其获得mecA基因或其它同系物，编码青霉素结合蛋白（PBP）、形成PBP2a，降低β-内酰胺抗生素活性，表现出对所有β-内酰胺类药物包括青霉素类、碳青霉烯类和头孢菌素类（除外具有抗MRSA活性的第五代头孢菌素如头孢罗膦）耐药。
【临床治疗】1.葡萄球菌的治疗包括迅速予以抗菌治疗和控制感染源，如去除与感染有关的血管导管和在有脓肿时行手术引流等操作；2.甲氧西林(苯唑西林)敏感葡萄球菌认为对下列抗菌药物也敏感：（1）β-内酰胺合剂(阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)；（2）口服头孢烯类(头孢克洛、头孢地尼、头孢氨苄、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢)；（3）注射头孢烯类包括一、二、三和四代头孢菌素类(头孢孟多、头孢唑林、头孢吡肟、头孢美唑、头孢尼西、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢替坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢罗膦、拉氧头孢)；（4）碳青霉烯类(多立培南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南)；3.除头孢罗膦外，甲氧西林(苯唑西林)耐药金黄色葡萄球菌对目前所有β-内酰胺类药物耐药，其所致感染的治疗首选万古霉素，次选治疗药物包括替考拉宁、利奈唑胺、达托霉索、特拉万星，头孢罗膦等。
食品微生物检验：葡萄球菌
凝固酶较耐热，在l00℃
5、溶纤维蛋白酶
可使人、犬、豚鼠及家兔的已经凝固的纤维蛋白溶
解。溶纤维蛋白酶是一种激酶，可激活血浆蛋白酶原
成为血浆蛋白酶而使纤维蛋白溶解。
凝固酶及溶纤维蛋白酶可在含有血浆的琼脂平板内
同时测定。初次培养后，菌落周围若出现一个不透明 圈，表示产生凝固酶，继续培养时，不透明圈消失， 说明为溶纤维蛋白酶作用的结果。
（一）形态与染色
典型的葡萄球菌呈球形，直径0.4µm-1.2µm，致病性葡萄
球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的大小及排列也较整
齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串
状排列。
在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排列，易误认为
链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽胞，一般不形成荚膜，易被碱 性染料着色，G+，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为革
食品中致病性球菌的检验
一、金黄色葡萄球菌的检验 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲 料、食品（剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动 物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物 寄生菌，也有一些致病的球菌。
食品中生长有金黄色葡萄球菌，是食品卫生的一种 潜在危险，因为金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食 后能引起食物中毒。因此，检查食品中金黄色葡萄球 菌有实际意义。
葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素
溶血毒素、杀白血球毒素、肠毒素、 血浆凝固酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶、脱
和酶的能力。
氧核糖核酸酶
1、溶血毒素
多数致病菌株能产生该毒素，使血琼脂平板菌落周 溶血毒素是一种外毒素，根据其对动物细胞的溶血
金黄色葡萄球菌国家标准检验方法
金黄色葡萄球菌国家标准检验方法一、国家标准检验办法参见GB 4789.10-2010《食品平安国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》其次法和第三法。
1、Baird-Parker平板计数（其次法）本办法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
1.1、检验流程 1.2、试验步骤 (1）样品的稀释①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。
②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL 稀释液的无菌试管中（注重吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合匀称，制成1：100的样品匀液。
④按③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
(2）样品的接种按照对样品污染情况的估量，挑选2-3个相宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在举行10倍递增稀释时，每个稀释度分离吸取1mL样品匀液以0.3mL, 0.3mL, 0.4mL接种量分离加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布囫囵平板，注重不要触及平板边缘。
用法前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。
(3）培养在通常状况下，涂布后，将平板静置l0min，如样液不易汲取，可将平板放在培养箱（(36±1)℃培养1h；等样品匀液汲取后翻转平皿，倒置于培养箱，(36±1)℃培养，45一48h。
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生理盐水
方法二：玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取
待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液， 若经10~20s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆 1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果 。
兔血浆制备 成分：柠檬酸钠0.106 mol/L （31.3g Na3C6H5O7·2H2O溶于1L蒸馏水中） 制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，
一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5% 氯化钠肉汤增菌。
所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌 株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。
金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和 溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放 脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。
生物学特性 ——致 病 性
金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主 要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌 体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶） e.肠毒素：引起急性胃肠炎。
选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面 干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）
微生物金黄色葡萄球菌
一、生物学特性——菌体形态及培养特征
革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成 对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。
大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色 到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄 色葡萄球菌。
大多数菌株最适生长温度30-37℃，最适pH为7.0-7.5； 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。
毒性，并使菌落产生黑色 ✓ 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 ✓ 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制
作用。
在BP平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光 滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或 灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用 接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。
25g样品+ 225ml 生理盐水
5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 24hr
定性 检测
血平板
BP平板
36± 1℃ 24hr 镜检与 肉浸液肉汤培养
36± 1℃ 24hr
血浆凝固酶 试验
36± 1℃ 6hr
报告结果
定量
25g样品+ 225ml 生理盐水
梯度稀释
检测
（平板法）
制法：加热融化琼脂，冷至50℃，以无菌操作加 入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装 灭菌试管，摆成斜面。
检验程序——分离培养
BP（贝尔德- 帕克）平板：
✓ 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素 和矿物元素
✓ 丙酮酸钠是一种生长促进剂 ✓ 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌， 临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺 炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
葡萄球菌皮肤感染
葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾 病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最 为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。
当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品， 如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经810小时即可相当数量的肠毒素。
36± 1℃ 24hr
血平板
36± 1℃ 24hr
7．5％氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 24hr
血平板 ，Baird-parker
涂片染色
观察溶血
血浆凝固酶试验
报告
检验程序 ——增菌培养
利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的 氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5% 氯化钠肉汤增菌。
二、检验程序与操作方法
根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准： 《食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验》 GB 4789.10-94
金黄色葡萄球菌检验
国标：金黄色葡 萄球菌检验程序
检样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水
直接计数方法
增菌培养方法
Baird-parker（贝尔德- 帕克） 0.3ml、0.3ml、0.4ml
置37摄氏度培养箱培养24小时。
检验程序 ——分离培养
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血 平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆 形，不透明，表面光滑，有溶血环。
大而突起，圆形，不透明， 表面光滑，有溶血环
血平板制作
成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维 羊血（或兔血）5-10mL。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑 色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。
B-P平板
检验程序 ——鉴定之革兰氏染色镜检
革兰氏阳性，球形，组成葡萄状
检验程序 ——鉴定之凝固酶试验
金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别 的主要试验是测定其凝固酶。
方法一：试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培
10min吸取上清液即为兔血浆。
葡萄糖肉浸液肉汤的制备
成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二 钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。
制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后 放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣 完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水 补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解 后校正pH，煮沸并过滤、分装，121℃30min高压灭菌。
养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇 匀，放36±1℃恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观 察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者， 被认为阳性结果。
试管法
阴性反应
阳性反应
不凝固
少量、 零散凝Leabharlann 固明显的块 状凝固
巨大块 凝固
完全凝固， 倒置不流动
有凝块
均匀混浊
血浆