细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏

一、实验原理

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜（DMSO）作保护剂，这种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二、细胞传代（分瓶）

1、生物安全柜（超净工作台）的使用次序：使用前开启紫外灯照射30min，然后工作台预工作15min以除去臭氧，再开始试验。

2、准备工作：⑴用75% 的酒精喷下戴手套的双手，同时用酒精棉球擦拭生物安全柜台。⑵倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶（传代）。

3、将培养皿中培养液（含有10%的胎牛血清，含血清的培养液配置方法：5ml的血清+45ml的基础培养液DMEM等）用塑料吸管吸去，贴壁加入PBS洗涤一次，以去除残留的血清（血清会抑制胰酶对细胞的消化）。

4、根据培养瓶的大小（常见为10ml和6ml的培养皿），加入适量的胰酶（10ml的加1ml），置于37℃培养箱，消化1分钟，观

察到贴壁细胞消化下来了（或倒置显微镜观察贴壁细胞逐渐趋于圆形时），加入含血清的培养液终止胰酶消化。

5、用吸管吸取冲洗皿底，将细胞悬液移至15ml离心管中离心1 000 rpm，5 min，21℃。

6、酒精喷下离心管，进入安全柜，弃上清，重新加入含血清的培养液，然后根据需要分瓶，置37℃培养箱继续培养。

三、细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化（本实验室直接放培养箱融化）；

2、加入PBS10ml，洗去DMSO，离心1 000 rpm，5 min；

3、弃去上清液，加入含10%血清的培养液，接种培养瓶，培养箱培养；

4、次日换液（培养液由红色清亮透明变浅变黄需换液），继续培养。

四、细胞冻存

1、取待冻存的细胞（按上述把贴壁细胞消化下来），1000rpm离心5min，弃上清；

2、加入1-1.5ml冻存液（含10%的二甲基亚砜DMSO和90%血清的DMEM培养液），吹打混匀；

3、移入冻存管（标记好细胞名称、冻存时间、冻存者），放入冻

存盒，再放入-80℃过夜，再至于液氮罐中。