核酸检测技术讲解

多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: Why
• Detect several genes at once
– eg. transgenic plant screen
• Internal controls
– VERY important – Tells you how well the PCR reaction worked – Reduces “false negatives” – Reduces “false positives”
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化 学奖
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
1989年美国《Science》 杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年 为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
The first cycle
The second cycle
How does PCR work
The third cycle
The fourth cycle
How does PCR work
2. PCR的类型
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR）
平台期
Rn（荧光强度）
平台期
基线期
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理——荧光域值
平台期
Rn（荧光强度）
指数扩 增期
基线期
荧光域值
Cycle（循环数）
手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最 高值；进入指数期的最初阶段
荧光定量PCR原理——Ct值
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数。
Nested Multiplex PCR
Primary Multiplex RT-PCR
1F 3F
4F
6F
2F 5F
1R 3R
4R
6R
2R 5R
2nd Stage PCR
Dilute 100 fold Between 1st & 2nd stage reactions
2.2 定量PCR（quantitative PCR）
荧光定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系 对起始模板进行定量分析。
与常规 PCR技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无 法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
（1）定量原理
如何对起始模板定量？
Denaturation：The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃
Primer annealing: The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal.
7. Overlap PCR
……
2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
Total Volume
34.0 ul 5.0 ul 2.5 ul 1.0 ul 1.0 ul 1.0 ul 1.0 ul 1.0 ul 1.0 ul 1.0 ul 0.5 ul 1.0 ul
50.0 ul
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: Example
Control Gene Resistance Gene Trait Gene
第2章 核酸检测技术
核酸检测技术
直接对动植物有害生物基因序列和结构进
行测定。
核酸的分离纯化 PCR技术 核酸杂交技术
பைடு நூலகம்1节 核酸的分离纯化
核酸的分离纯化的原则
1. 保持核酸一级结构的完整性 2. 提高核酸制品的纯度
技术路线的设计
机械 （匀浆、超声破、研磨等）
破碎细胞的方法
非机械（化学处理、生化法）
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: Example
• Three primer pairs
Control Gene Resistance Gene Trait Gene
Primers
Which are transgenic?
多重PCR（multiplex PCR）
Log of DNA concentration
（2）荧光定量PCR的化学原理
1. Hydrolysis probes （水解探针） (TaqMan, Beacons) 2. DNA-binding (intercalating) agents （结合） (SYBR Green, Eva Green, LC Green) 3. Hybridization or FRET probes （杂交） (Light Cycler)
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
荧光定量PCR原理 ——扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、 指数增长期和平台期。
完整性测定 琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核 酸凝胶电泳结果为依据。
基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧 光强度积分应呈特定的比值
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯
抑制后续酶解和PCR反应
DNA提取常见问题 问题二： DNA降解
DNA提取常见问题 问题三： DNA提取量少
Polymerase
Components：
PCR Chain
Reaction
Thermostable DNA Polymerase， Target DNA，Pair of Primers， dNTPs， Mg++ ions， Buffer solution
The PCR cycle: Three different steps in each PCR cycle
真菌
昆虫
第2节 PCR扩增技术
PCR, a ‘DNA photocopier’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
扩增效率 E（amplification efficiency）一个循环后
的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于 0到1之间。
在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数 扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平 台期，不再扩增。
扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度 的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到 一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线 斜率）即可计算出E值。
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。
乙醇 异丙醇
优点
缺点
对盐类沉淀少， 需要量大，低温操 易挥发除去，不 作 影响后续实验
需体积小，速度 易使盐类、糖类与 快，一般不需低 DNA共沉淀；异丙 温长时间放置 醇难以挥发除去
核酸浓度检测与完整性测定方法
浓度测定 紫外分光光度法 荧光光度法
260nm EB荧光
Primers
• Three primer pairs
– Control, resistance, and trait genes
• Control gene fragment is largest and (almost) faintest
• Trait gene is smallest and brightest
实时荧光定量PCR （Real time Quantitative PCR）： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始 模板进行定量分析的方法。
Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint detection
在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0 (1+Ex)Ct =M
(1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.
在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M
方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)
整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) CT = - k lg X0+ b （线性方程）
多重PCR（multiplex PCR）
A Typical Multiplex PCR Reaction
Sterile Water 10X PCR Buffer MgCl2 (50mM) dNTP’s (10mM each)
Primer1FWD Primer1REV Primer2FWD Primer2REV Primer3FWD Primer3REV DNA Polymerase DNA Template
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
1. PCR的基础
Polymerase
PCR Chain
Reaction
The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.
Polymerase
PCR Chain
Reaction
The products of the first reaction become substrates of the following one, and so on.
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人 发明了聚合酶链反应（PCR）
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率 的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台 PCR自动化热循环仪
C(t) value
Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性
定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
LogX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环 数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
Sample
Ck 104
Ck 102
模板DNA量越多， 荧光达到域值的循环 数越少，即Ct值越小。
Log模板起始浓 度与Ct值呈线性关系。
Cycle number
Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+.
PCR的扩增？