生物素-亲和素标记技术完整讲解
标记亲和素生物素法
标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法是一种常用的生物化学实验技术，用于研究蛋白质的相互作用。
本文将介绍亲和素生物素法的原理、应用和实验步骤。
一、原理亲和素生物素法基于生物素（biotin）与亲和素（avidin或streptavidin）之间的高度特异性结合。
生物素是一种水溶性维生素，与亲和素结合后形成稳定的复合物。
利用这种结合关系，可以将含有生物素的分子与亲和素结合，从而实现对目标分子的标记和纯化。
二、应用亲和素生物素法在生物科学研究中有广泛的应用。
其中一些主要应用包括：1. 蛋白质纯化：通过将含有生物素的标签蛋白与亲和素结合，可以实现对目标蛋白的高效纯化。
2. 免疫组化：生物素标记的抗体可以与细胞或组织中的特定抗原结合，从而实现对抗原的检测和定位。
3. 蛋白质相互作用研究：通过将目标蛋白与生物素标记的配体蛋白结合，可以研究蛋白质的相互作用和信号传导机制。
三、实验步骤亲和素生物素法的实验步骤主要包括以下几个方面：1. 标记生物素：将生物素与所需标记的分子（如蛋白质或核酸）进行化学反应，将生物素引入目标分子中。
2. 制备亲和素柱：将亲和素（如avidin或streptavidin）固定在柱子上，形成亲和素柱。
亲和素柱可以商购买或自行制备。
3. 样品处理：将标记了生物素的分子与亲和素柱接触，使其与亲和素结合。
4. 洗脱：通过改变溶液条件，如改变pH值或添加竞争性配体，使亲和素与目标分子解离，从而洗脱目标分子。
5. 分析和应用：将洗脱得到的目标分子用于后续实验或分析，如Western blot、质谱分析等。
四、实验注意事项在进行亲和素生物素法实验时，需要注意以下几点：1. 使用高纯度的生物素和亲和素，以确保实验结果的准确性。
2. 选择适当的洗脱条件，以实现目标分子的高效洗脱。
3. 控制实验中的非特异性结合，以减少背景信号。
4. 根据实验需要选择合适的生物素标记方法，如目标分子的标记位置和标记方式（N-末端、C-末端或内部标记）。
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
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亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的
量来表示； 结合1μg生物素所需要
的亲合素量为1个亲合素 活性单位。一般1mg亲合 素约含13～15个活性单 位。
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链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。
由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白 质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链 构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测 灵敏度明显优于A。
糖基化
多糖基化
无糖基化
结合生物素能力
4
4
亲和常数（K）
1015
1015
活性（U）
13～15
15～18
亲和素和链霉亲合素理化特性比较 9
第二节 生物素和亲和素 标记物的制备
一、生物素标记物的制备
1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性 物质如抗原、抗体；
根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点
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BAB法(直接法)检测原理示意图
18
二、标记亲和素－生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB）
直接法
间接法
LAB法(直接法)检测原理示意图
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三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）
ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图
四、酶－抗酶－亲和素－生物素化酶 复合物法（PAP-ABC）
tlymphocytebab法直接法检测原理示意图二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab直接法间接法lab法直接法检测原理示意图abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc第四节技术评价与应用领域一技术评价1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同
生物素、亲和素标记技术
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1
一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
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2
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。
2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
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2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
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五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
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六、技术类型：
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在次基础上 引入A-B系统。
1 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A
B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
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2 BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-
DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺 标记特点：
BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的
适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA
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6பைடு நூலகம்
2 长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
生物素（biotin，B）, 又称维生素H 、B7,动 植物中广泛存在，卵黄 和肝中含量高；
MW244.31D,有两个环状 结构；
Ⅰ环为咪唑酮环，为与 亲和素结合部位；
Ⅱ环为噻吩环，含一个 戊酸侧链，其末端可与 生物大分子连接，形成 生物素标记物。
咪唑酮环 噻吩环
羧基
3
活化生物素 噻吩环上戊酸侧链
第十三章
生物素－链霉亲 和素标记免疫技术
Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech
1
第一节 生物素和亲和素 第二节 生物素和亲和素标记物的制备 第三节 生物素和亲和素系统的技术方法 第四节 技术评价与应用领域
2
T lymphocyte
第一节 生物素和亲和素
PAP-ABC复合法检测原理示意图
第四节 技术评价与应用领域
一、技术评价 1、生物素（B）和亲和素（A）之间的
高亲和力，使反应试剂经得起高度稀 释，降低或避免了非特异性结合； 2、二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖 等活性物质； 3、具有多级放大作用，使其具有高灵 敏性；
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二、应用领域 1、BAS与免疫标记技术 适用于微量抗原、抗体及其他生物活性物质
可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记 后活性会降低；
5
亲和素（avidin,A） 从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种
蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组 成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。 与生物素结合的特异性高、稳定性好。
K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）
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二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲
生物素-链霉亲和素,作为荧光标记
生物素-链霉亲和素，作为荧光标记一、生物素-链霉亲和素的定义生物素-链霉亲和素是一种用于标记生物分子的荧光标记物。
它是由生物素和链霉亲和素组成的复合物。
生物素是一种维生素B7，也称作维生素H，它与链霉亲和素的结合具有较高的亲和力。
链霉亲和素则是一种可以与生物素结合并发出荧光的物质。
将生物素-链霉亲和素与所需标记的生物分子结合后，可以利用链霉亲和素的荧光发射信号来对生物分子进行检测和观察。
二、生物素-链霉亲和素的制备生物素-链霉亲和素通常通过化学合成的方式进行制备。
首先需要合成生物素分子和链霉亲和素分子，然后将两者进行反应结合，得到生物素-链霉亲和素复合物。
制备好的生物素-链霉亲和素可以在实验室中用于各种生物标记的研究工作。
三、生物素-链霉亲和素的特性1. 高亲和力：生物素和链霉亲和素之间的结合具有较高的亲和力，能够稳定地结合在一起，确保标记物在实验过程中不会轻易分离。
2. 显著荧光特性：生物素-链霉亲和素复合物具有明显的荧光特性，可以在适当的荧光激发条件下发出强烈的荧光信号，便于实验者进行观察和测量。
3. 稳定性：生物素-链霉亲和素复合物在适当的条件下具有良好的稳定性，可以在实验室中长时间保存和使用。
四、生物素-链霉亲和素在生物学研究中的应用1. 蛋白质标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记目标蛋白质，通过观察蛋白质的荧光信号，可以研究蛋白质在细胞中的表达和定位等信息。
2. 细胞标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记细胞膜表面的生物分子，有助于研究细胞相互作用和信号传导等生物学过程。
3. 分子探针：生物素-链霉亲和素作为一种标记物，可以用于研究分子间的相互作用和结构等相关信息。
4. 荧光显微镜：生物素-链霉亲和素标记的细胞和分子可以在荧光显微镜下观察，进一步拓展了荧光显微镜技术在生物学研究中的应用。
五、结语生物素-链霉亲和素作为一种荧光标记物，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它具有高亲和力、显著的荧光特性和良好的稳定性，能够在生物标记的实验中提供可靠的信号和结果。
生物素-亲和素
生物素-亲和素生物素－亲和素系统（Biotin-Avidin System，以下简称BAS）是半个世纪前发现的一种新型生物反应放大系统。
生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏，生物素－亲和素系统目前已广泛用于抗原、抗体的定性、定量检测及定位观察研究。
生物素（D-biotin）分子结构见图，分子量244.31Da．生物素分子有两个环状结构（如下左图），其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位；噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（如下右图）亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD。
4个相同的亚基使每个亲和素能最多可结合4个分子的生物素。
生物素与亲和素之间具有极强的亲和力，比抗原与抗体间的亲和力高得多。
并且，二者的结合稳定性好、专一性强。
生物素－亲和素系统有哪些优点：灵敏度生物素易与蛋白质、核酸类及其他生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且具有多价性。
此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。
因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性亲和素与生物素间的结合呈高度特异性。
因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。
而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响。
因此，在实际应用中可**限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白水解酶以及有机溶剂均不影响其结合。
因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
生物素-亲和素
该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素、亲和素标记技术
2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
3 生物素酰肼(BHZ)：
制备：生物素 +水合肼 标记特点： BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记
适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
1 概念： 亲和素(avidin)：是动物微生物中提 取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。 链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养 液中提取的一种蛋白质 2 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD
3 ABC法： ⑴ A+B· E ⑵ Ag+B· Ab
A- B· E----------ABC Ag-Ab· ABC Ag-Ab· B B-ABC
பைடு நூலகம்
特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复 合物ABC
+A
+A
返回
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
返回
3 结构特点： 咪唑酮环/四氢噻吩环 结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质
4 溶解特性： 难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)
5 等电点： PH=3.5 6 其它特性： 羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 （羧基活化的生物素，称为活化生物素， 也叫生物素衍生物）
生物素-亲和素标记技术完整讲解
直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
亲和素-生物素修饰纳米材料-概述说明以及解释
亲和素-生物素修饰纳米材料-概述说明以及解释1.引言1.1 概述亲和素-生物素修饰纳米材料是一种新兴的研究领域，通过将亲和素（affinity ligands）与生物素（biotin）结合，将其修饰到纳米材料表面，实现了一种新的功能化材料设计思路。
亲和素是一种具有特异性结合能力的分子，能够与特定的配体或靶标相互作用。
生物素则是一种小分子化合物，与亲和素具有高度的结合亲和力。
由于亲和素与生物素之间的非共價相互作用，亲和素-生物素修饰纳米材料在生物学、医学以及材料科学等领域展示了广泛的研究前景。
亲和素-生物素修饰纳米材料具有多种优势，首先是其结合特异性和高度选择性。
通过选择合适的亲和素和生物素，可以实现与不同的配体或靶标的特异性结合，从而实现对目标物质的高度选择性的识别和分离。
其次，亲和素-生物素修饰纳米材料的制备方法相对简单、灵活且可控性强。
通过调控亲和素和生物素的修饰方式和比例，可以实现对纳米材料表面化学性质的调节，从而优化其在不同领域的应用。
此外，由于亲和素-生物素修饰纳米材料具有较好的生物相容性和生物安全性，其在生物医学领域的应用具有巨大潜力。
然而，亲和素-生物素修饰纳米材料的研究也面临一些挑战。
首先，选择合适的亲和素和生物素对于实现目标特异性识别非常重要，但是目前对于不同生物系统的特异性结合机理的理解还有待深入研究。
其次，纳米材料的修饰表面与层间结构对修饰效果和修饰密度都具有重要影响，因此需要进一步优化纳米材料的表面修饰方法和结构设计。
此外，亲和素-生物素修饰纳米材料在大规模制备和应用上面临一定的技术和经济上的挑战，需要进一步改进和突破。
综上所述，亲和素-生物素修饰纳米材料具有广阔的应用前景和研究价值，其在生物学、医学和材料科学领域的研究将为开展更多的基础研究和应用探索提供新的思路和方法。
随着对亲和素-生物素修饰纳米材料的深入了解和技术的不断进步，相信其在生物医学和纳米技术领域的应用前景将愈加广阔。
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A
二）亲和素和链霉亲和素
❖(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
BA法在间接ELISA中的应用
+A-E
3 ABC法：
⑴ A+B·☼
⑵ Ag+Ab·B
A- B·☼ ----------ABC
Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC
特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中 的A先与B-E结合，制备成复合物ABC； 操作比BAB法简便，但仍然保持较高的 灵敏度。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
免疫-PCR
一、主要程序
1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复 合物；
2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合 物；
1.特异性强：
亲和素和生物素间的高亲和力。
2.灵敏度高：
每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。
3.快速、稳定： 4.应用广泛：
可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合；
二、 BAS的基本类型及原理
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、 间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。 ❖ BAB法： ❖ BA法： ❖ ABC法：
生物素亲和素
生物素亲和素生物素亲和素3篇生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。
1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。
如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。
计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。
2、在打开之前，平衡生物素至室温。
加2mgSulfo-NHS-Biotin 于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。
4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的.管中。
5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。
6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。
HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。
如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。
比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。
2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。
3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。
临床检验技师临床免疫学和免疫检验生物素-亲和素放大技术讲义
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成BLAHS。
BLAHS中的-C=0基团与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ，用于偏酸性糖蛋白的生物素标记）和肼化生物胞素（BGHZ）。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素通过羧基与多种大分子偶联活化。
一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，在与亲和素的反应中成为多价。
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。
通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
（三）标记注意事项1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
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直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法：
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法
间接法
（3）标记生物素-抗生物素法 标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
4.1.5 在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗 体，然后连接亲和素-酶结合物(BA-ELISA)、或亲 和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABCELISA)，从而使反应信号放大，提高检测的灵敏 度。王传彬等用生物素标记的纯化抗禽流感病毒 H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚 型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株， 与血凝和血凝抑制试验比较，纯化后的单抗具有 良好的反应活性。祝军等将BA-辣根过氧化物酶 复合物系统ELISA策略，对ANEPⅢ寡核苷酸适配 子的亲合力进行测定。
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡
2.上样
3.洗杂 具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。 2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素 衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生 物活性。 3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度 专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低 受影响。 4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结 合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在 结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。 5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合， 还可制成亲和介质，用于分离提纯。 6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。
酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤（间接法）
1 包被抗原 2 洗涤 3 待测血清（抗体） 4 洗涤 5 酶标二抗 6 洗涤 7 显示物A、B 8 加终止液 (H2SO4)
酶标板
桥-亲和素-生物素标记（BAB法）步骤
间接法步骤：
1包被抗原 2洗涤 3待测抗体 4洗涤 5生物素标二抗 6洗涤 7加亲和素 8洗涤 9加酶标生物素 10洗涤 11加底物 12显色后加终止液
四 应用
1
在免疫学中的应用
免疫荧光技术中的应用 免疫放射技术中的应用 胶体金技术中的应用 免疫酶技术中的应用 ELISA中的应用
2
3
4
在分子生物学中的应用 在组织化学中的应用 在分离纯化中的应用（亲和层析）
4.1 在免疫学中的应用
4.1.1 在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay，FIA)技术， 可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)或采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥， 两端分别连接生物素和荧光素。与常规荧光抗体法或单独的BAS标记法相比， BAS标记法结合荧光抗体技术可明显地提高检测的灵敏度和特异性。 张锦明等用99Tcm替代111In标记BAS在肿瘤放免显像预定位DTPA-生物素溶液， 结果测得99Tcm-DTPA-生物素的标记率大于90%。 4.1.2 在免疫放射技术中的应用 BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星。4.2 在分子生物学中的应用
BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要 集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫 测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗 原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷 (dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来，以生物素化多核苷酸为 探针的核酸杂交技术有了很大发展，常用于Southern、 Northern和原位杂交等。试验时，标记探针先与细胞或染 色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进 行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲 和素)识别杂交互补片段，使其显色或产生荧光，这种技 术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点，应用潜力很 大。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
4.1.3在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术，其原理为带正电荷的链霉亲 和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合， 使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得 到扩大。吕丰等应用石英晶体微天平(QCM)研究了基于 BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，结果在利用BAS固定过的 葡萄糖氧化酶过程中，经过纳米金颗粒修饰的QCM基片 对酶的吸附量比未经修饰的基片多。张志锋等以组装型金 磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
卵白亲合素
亲合素
链亲合素 卵黄亲合素 类亲合素等
后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。
二 原理
20世纪60年代初发现了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin，A)， 其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，是目前发现的自然界中 具有最强亲和力的物质。
每个 分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物 活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子 又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素-生物素标记法(Labeled avidinbiotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidinbiotin, BAB)和 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxid ase complex，ABC)。 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发 展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并 与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步 提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。