2-3-蛋白质的结晶
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从浓盐溶液中结晶，形成晶核的时间短（几小 时），但结晶生长较慢（数周、数月）。 但也有例外，牛肝过氧化氢酶从盐溶液中形成大 的单晶只需12-24小时。 结晶大小与结晶时间、结晶条件有关。大晶体通 常是在生长较慢的情况下得到的。
（五）pH值
pH不仅影响晶体的大小，也影响晶体的形状。 因为很多蛋白质对pH非常敏感，有时，无定形 沉淀、微晶和大单晶之间的pH差别只有0.2 pH 单位，或者更小，因此，必须选定恰当的缓冲液。 结晶溶液的pH值一般应选择在被结晶蛋白质的 等电点附近，这样有利于结晶的析出。
二、结晶条件
对于不同的蛋白质或酶，其结晶条件各不相同， 下面讨论影响蛋白质结晶的一些因素。
（一）蛋白质纯度
样品纯度越高，结晶越容易，混杂蛋白质的 存在有时是影响单晶长大的主要障碍，甚至影 响微晶形成。 但多大的纯度才能形成结晶，没有统一标准， 通常不应低于50%。
（二）蛋白质浓度
通常应保持尽可能高的蛋白质浓度。浓度越 高，结晶机会越大。这是因为蛋白质分子的扩 散速度慢，相互碰撞聚合的聚会增多。在稀溶 液中不易形成晶核。但在过饱和状态下结晶， 杂质含量多，形成的多是微小晶体，而且晶形 不好。
（四）脱盐结晶
球蛋白易于溶于盐溶液中而几乎不溶于水。这 一性质可用与蛋白质结晶。用透析法即可达到 除盐的目的。
（五）温差结晶
蛋白质在低离子强度下，对温度特别敏感， 其溶解度随温度变化极大。
因此，可用温差法使其结晶。例如猪胰弹性 蛋白酶(9mg/ml,内含pH5.5,0.05M柠檬酸钠缓 冲液)溶液的温度逐渐由25℃降至20℃，晶体 在24小时内形成。
（六）金属离子和离子强度
离子强度直接蛋白质的溶解度影响。 金属离子有助于蛋白质结晶过程。 有些金属离子（特别是二价的）有促进结晶长 大的作用，如在硫酸铵溶液中的铁蛋白，加入少 量镉离子后能形成菱形结晶。
（Biblioteka Baidu）晶核
晶核在结晶开始，既当蛋白质达到饱和点就有 可能形成。控制晶核数的方法往往是调整过饱和 度。 一般来说，晶核数越少，越容易生成大晶体。
需要晶种才能形成结晶的蛋白质，一般结晶收 率都不高。结晶条件还受微量杂质，气泡，还原 剂，甚至底物、辅酶、压力、种属来源等因素影 响，必须给予充分重视和考虑。
三、结晶方法
一般来说，能沉淀蛋白质的方法都可用作结 晶方法，常用的方法有下列几种：
（一）盐析法
盐析是通过加盐降低蛋白质溶解度，使其 从溶解状态转变成果饱和状态，于是以结晶 形式从溶液中析出。 结晶用盐有各种无机盐（如硫酸铵），有 机盐（如柠檬酸钠、十六烷基三甲基铵盐） 和各种分子量的聚乙二醇等。
2)样品溶液与有机溶剂分别置于密闭容器中（如 干燥器），可避免直接加入法易产生无定形沉 淀的弊病。
3. 固体融化
将有机溶剂与水1：1混合后冷却，然后将其加投 入到冷冻干燥的蛋白质干粉中。 一般来说，蛋白质干粉由浸润膨胀而成粘稠状， 再由粘稠状转成结晶。
（三）等电点结晶
蛋白质溶解度受溶液pH影响。当蛋白质净电荷 等于零时，即在等电点时，其溶解度往往最小， 所以，可利用这一性质作等电点结晶。
（六）金属离子
因为金属离子常能促进蛋白质结晶生成，所 以，在其它方法未获成功时，不妨尝试此法。 例如，硫氧还原蛋白从pH3.5-9.0，各种结 晶试验均未获得成功。但加入醋酸铜后，则出 现结晶。具体条件是：蛋白质浓度5mg/ml，用 微量透析法，4℃，对透析液（pH4.5, 0.01M 醋酸钠缓冲液，内含0.001M醋酸铜，20-25%乙 醇）透析2天后，晶体出现。
盐类既可以以固体的形式加入，也可以以饱和 盐溶液形式加入。加盐时应注意边加边搅拌，防 止局部盐溶液浓度过高，但是搅拌也不能激烈， 以免出气泡。 当发现盐溶解速度明显变慢，则应在沉淀完全 溶解后，静止片刻，观察溶液是否出现浊光。 加入的盐量应以维持浊度不消失为度。
加饱和盐溶液的优点是溶液与溶液易于混合， 避免局部盐浓度过高，同时可避免气泡的产生。
蛋白质结晶过程类似于凝聚过程，就是在一 定的溶剂条件下，降低溶质溶解度，使溶质处 于过饱和状态。在合适的过饱和状态下，溶质 分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式、形成 晶核。然后溶质分子以相互对撞的作用方式有 序而反复地堆砌到晶核上。于是晶核长大，晶 体形成，从溶液中析出。 蛋白质结晶作用主要有两个因素决定： 1. 溶解度，即热力学平衡因素； 2. 动力学因素，即控制晶核过程和晶核生长。
使用这种方法时有两点要注意：
1. 温度：在0-4 ℃为宜
2. 局部浓度不要太高。
所以加入的有机溶剂时，先将其冷却至0℃左 右 。常用的有机溶剂有乙醇、MPD、丙酮、乙 腈、二氧杂环乙烷、二甲基亚砜、丁内酯等。
加入有机溶剂的方式有下列几种：
1. 直接加入有机溶剂 这时要注意搅拌、慢慢滴加、同时要测量温度。 2. 气体平衡扩散 这是利用有机溶剂的挥发性，通过气体扩散而将 溶剂加到蛋白质溶液中的方法。此法的优点是： 1)可缩短结晶时间
用透析的方法来增加样品的盐浓度: 样品溶于水后，装入透析袋中，再将透析袋放入制 好的结晶用的盐溶液中。 内外液的体积比一般为1：10。结晶过程中，有时 要更换外液几次。
缓慢蒸发也可以提高盐浓度。将容器用 parafilm封口，然后在膜上用针开孔、放置、 令其浓缩。
（二）有机溶剂法
有机溶剂脱水作用会使大多数蛋白质的溶 解度降低。其优点是有机溶剂介电常数小， 所以，有机溶剂掺入蛋白质溶液后，使溶液 介电常数下降，导致蛋白质结晶析出。
对蛋白质来讲，结晶作用还有另外两个重要的 意义： 1.作为一个稳定贮存方法 2.供X光衍射分析用
一、基本原理
蛋白质结晶原理与一般的小分子类似。不同的是， 蛋白质分子的不稳定性和敏感性较大，必须维持 其基本水合状态，处于或接近生理pH及温度。保 持蛋白质分子的天然状态对蛋白质的结晶至关重 要。
对多数蛋白质或酶来说，浓度在10-50mg/ml 为 好。
（三）温度
温度是影响蛋白质溶解度的重要参数之一。 一般是在低温下进行结晶。低温不仅使蛋白 质的溶解度降低，而且不易使蛋白质变性。 已知的蛋白质结晶温度在0-40℃之间。 通常选择4℃冷室或25℃温箱进行结晶。
（四）结晶时间
晶体形成需要充分时间，从几个小时到几个月不 等。这是因为蛋白质分子庞大，所以结晶过程缓慢。
（八）沉淀剂
沉淀剂可改变蛋白质的溶解度。
盐类和各种有机溶剂都可用作沉淀剂。
大多数盐类影响蛋白质的溶解度是通过盐析或 盐溶作用。 近年发现两种有机物是理想的使蛋白质结晶的 物 质 ： 聚 乙 二 醇 (PEG) 和 2- 甲 基 -2, 4- 戊 二 醇 (MPD)。
（九）其它
有的蛋白质或酶不易结晶，如胰凝乳蛋白酶。 但如果加入微量的胰凝乳蛋白酶结晶，常常可导 致大量结晶的出现。有时用玻璃棒轻轻磨擦器壁， 也能促进结晶的形成。
第七节 蛋白质的结晶
牛胰岛素结晶
在蛋白质提纯过程中，当蛋白质达到一 定纯度时，就可以进行蛋白质的结晶。 现在蛋白质的结晶被认为是使样品达到均一状态 的必要的提纯步骤。但是，结晶样品不一定是纯 的。有时蛋白质或酶的第一次结晶纯度低于50%， 其中可能含有杂质。 当重结晶时，若比活力有所增加，则要反复结晶 几次，直至比活力提高到一个最大的恒定值。所 以，重结晶法实际上是提纯后期的一个部分分级 方法。
（五）pH值
pH不仅影响晶体的大小，也影响晶体的形状。 因为很多蛋白质对pH非常敏感，有时，无定形 沉淀、微晶和大单晶之间的pH差别只有0.2 pH 单位，或者更小，因此，必须选定恰当的缓冲液。 结晶溶液的pH值一般应选择在被结晶蛋白质的 等电点附近，这样有利于结晶的析出。
二、结晶条件
对于不同的蛋白质或酶，其结晶条件各不相同， 下面讨论影响蛋白质结晶的一些因素。
（一）蛋白质纯度
样品纯度越高，结晶越容易，混杂蛋白质的 存在有时是影响单晶长大的主要障碍，甚至影 响微晶形成。 但多大的纯度才能形成结晶，没有统一标准， 通常不应低于50%。
（二）蛋白质浓度
通常应保持尽可能高的蛋白质浓度。浓度越 高，结晶机会越大。这是因为蛋白质分子的扩 散速度慢，相互碰撞聚合的聚会增多。在稀溶 液中不易形成晶核。但在过饱和状态下结晶， 杂质含量多，形成的多是微小晶体，而且晶形 不好。
（四）脱盐结晶
球蛋白易于溶于盐溶液中而几乎不溶于水。这 一性质可用与蛋白质结晶。用透析法即可达到 除盐的目的。
（五）温差结晶
蛋白质在低离子强度下，对温度特别敏感， 其溶解度随温度变化极大。
因此，可用温差法使其结晶。例如猪胰弹性 蛋白酶(9mg/ml,内含pH5.5,0.05M柠檬酸钠缓 冲液)溶液的温度逐渐由25℃降至20℃，晶体 在24小时内形成。
（六）金属离子和离子强度
离子强度直接蛋白质的溶解度影响。 金属离子有助于蛋白质结晶过程。 有些金属离子（特别是二价的）有促进结晶长 大的作用，如在硫酸铵溶液中的铁蛋白，加入少 量镉离子后能形成菱形结晶。
（Biblioteka Baidu）晶核
晶核在结晶开始，既当蛋白质达到饱和点就有 可能形成。控制晶核数的方法往往是调整过饱和 度。 一般来说，晶核数越少，越容易生成大晶体。
需要晶种才能形成结晶的蛋白质，一般结晶收 率都不高。结晶条件还受微量杂质，气泡，还原 剂，甚至底物、辅酶、压力、种属来源等因素影 响，必须给予充分重视和考虑。
三、结晶方法
一般来说，能沉淀蛋白质的方法都可用作结 晶方法，常用的方法有下列几种：
（一）盐析法
盐析是通过加盐降低蛋白质溶解度，使其 从溶解状态转变成果饱和状态，于是以结晶 形式从溶液中析出。 结晶用盐有各种无机盐（如硫酸铵），有 机盐（如柠檬酸钠、十六烷基三甲基铵盐） 和各种分子量的聚乙二醇等。
2)样品溶液与有机溶剂分别置于密闭容器中（如 干燥器），可避免直接加入法易产生无定形沉 淀的弊病。
3. 固体融化
将有机溶剂与水1：1混合后冷却，然后将其加投 入到冷冻干燥的蛋白质干粉中。 一般来说，蛋白质干粉由浸润膨胀而成粘稠状， 再由粘稠状转成结晶。
（三）等电点结晶
蛋白质溶解度受溶液pH影响。当蛋白质净电荷 等于零时，即在等电点时，其溶解度往往最小， 所以，可利用这一性质作等电点结晶。
（六）金属离子
因为金属离子常能促进蛋白质结晶生成，所 以，在其它方法未获成功时，不妨尝试此法。 例如，硫氧还原蛋白从pH3.5-9.0，各种结 晶试验均未获得成功。但加入醋酸铜后，则出 现结晶。具体条件是：蛋白质浓度5mg/ml，用 微量透析法，4℃，对透析液（pH4.5, 0.01M 醋酸钠缓冲液，内含0.001M醋酸铜，20-25%乙 醇）透析2天后，晶体出现。
盐类既可以以固体的形式加入，也可以以饱和 盐溶液形式加入。加盐时应注意边加边搅拌，防 止局部盐溶液浓度过高，但是搅拌也不能激烈， 以免出气泡。 当发现盐溶解速度明显变慢，则应在沉淀完全 溶解后，静止片刻，观察溶液是否出现浊光。 加入的盐量应以维持浊度不消失为度。
加饱和盐溶液的优点是溶液与溶液易于混合， 避免局部盐浓度过高，同时可避免气泡的产生。
蛋白质结晶过程类似于凝聚过程，就是在一 定的溶剂条件下，降低溶质溶解度，使溶质处 于过饱和状态。在合适的过饱和状态下，溶质 分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式、形成 晶核。然后溶质分子以相互对撞的作用方式有 序而反复地堆砌到晶核上。于是晶核长大，晶 体形成，从溶液中析出。 蛋白质结晶作用主要有两个因素决定： 1. 溶解度，即热力学平衡因素； 2. 动力学因素，即控制晶核过程和晶核生长。
使用这种方法时有两点要注意：
1. 温度：在0-4 ℃为宜
2. 局部浓度不要太高。
所以加入的有机溶剂时，先将其冷却至0℃左 右 。常用的有机溶剂有乙醇、MPD、丙酮、乙 腈、二氧杂环乙烷、二甲基亚砜、丁内酯等。
加入有机溶剂的方式有下列几种：
1. 直接加入有机溶剂 这时要注意搅拌、慢慢滴加、同时要测量温度。 2. 气体平衡扩散 这是利用有机溶剂的挥发性，通过气体扩散而将 溶剂加到蛋白质溶液中的方法。此法的优点是： 1)可缩短结晶时间
用透析的方法来增加样品的盐浓度: 样品溶于水后，装入透析袋中，再将透析袋放入制 好的结晶用的盐溶液中。 内外液的体积比一般为1：10。结晶过程中，有时 要更换外液几次。
缓慢蒸发也可以提高盐浓度。将容器用 parafilm封口，然后在膜上用针开孔、放置、 令其浓缩。
（二）有机溶剂法
有机溶剂脱水作用会使大多数蛋白质的溶 解度降低。其优点是有机溶剂介电常数小， 所以，有机溶剂掺入蛋白质溶液后，使溶液 介电常数下降，导致蛋白质结晶析出。
对蛋白质来讲，结晶作用还有另外两个重要的 意义： 1.作为一个稳定贮存方法 2.供X光衍射分析用
一、基本原理
蛋白质结晶原理与一般的小分子类似。不同的是， 蛋白质分子的不稳定性和敏感性较大，必须维持 其基本水合状态，处于或接近生理pH及温度。保 持蛋白质分子的天然状态对蛋白质的结晶至关重 要。
对多数蛋白质或酶来说，浓度在10-50mg/ml 为 好。
（三）温度
温度是影响蛋白质溶解度的重要参数之一。 一般是在低温下进行结晶。低温不仅使蛋白 质的溶解度降低，而且不易使蛋白质变性。 已知的蛋白质结晶温度在0-40℃之间。 通常选择4℃冷室或25℃温箱进行结晶。
（四）结晶时间
晶体形成需要充分时间，从几个小时到几个月不 等。这是因为蛋白质分子庞大，所以结晶过程缓慢。
（八）沉淀剂
沉淀剂可改变蛋白质的溶解度。
盐类和各种有机溶剂都可用作沉淀剂。
大多数盐类影响蛋白质的溶解度是通过盐析或 盐溶作用。 近年发现两种有机物是理想的使蛋白质结晶的 物 质 ： 聚 乙 二 醇 (PEG) 和 2- 甲 基 -2, 4- 戊 二 醇 (MPD)。
（九）其它
有的蛋白质或酶不易结晶，如胰凝乳蛋白酶。 但如果加入微量的胰凝乳蛋白酶结晶，常常可导 致大量结晶的出现。有时用玻璃棒轻轻磨擦器壁， 也能促进结晶的形成。
第七节 蛋白质的结晶
牛胰岛素结晶
在蛋白质提纯过程中，当蛋白质达到一 定纯度时，就可以进行蛋白质的结晶。 现在蛋白质的结晶被认为是使样品达到均一状态 的必要的提纯步骤。但是，结晶样品不一定是纯 的。有时蛋白质或酶的第一次结晶纯度低于50%， 其中可能含有杂质。 当重结晶时，若比活力有所增加，则要反复结晶 几次，直至比活力提高到一个最大的恒定值。所 以，重结晶法实际上是提纯后期的一个部分分级 方法。