达肝素钠对A549细胞生长状态及细胞周期的影响(一)

达肝素钠对A549细胞生长状态及细胞周期的影响(一)

作者：陈克芳陈芳兰黄龙杰

【摘要】目的研究达肝素钠对体外生长的肺腺癌A549细胞活性及细胞周期的影响。方法用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT 方法在4个时间点(6、12、24和36h)检测细胞活性;将经过24h普通培养的A549细胞继续在含有50IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24h 后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期。结果达肝素钠降低A549细胞活性，这种作用表现出时间依赖性和浓度依赖性;达肝素钠主要抑制细胞在G1期。结论达肝素钠对A549细胞活性的降低与对细胞周期的抑制作用有关。

【关键词】低分子量肝素;达肝素钠;肺腺癌;细胞周期

肝素及其衍生物的抗细胞增殖作用，目前在平滑肌上进行的研究较多。Guyton等〔1〕报道，不论在体内还是在体外，肝素都能降低平滑肌细胞(SMC)的有丝分裂。其他部位的SMC，如气道及肠道、子宫肌层及子宫肌瘤的生长也能被肝素抑制〔2〕。也有在内皮细胞上进行的关于肝素的抗增殖作用研究，如Khorana等〔3〕报道肝素抗微血管内皮细胞(MVECs)和奇静脉内皮细胞的作用。关于未分级肝素(UFH)或低分子肝素(LMWH)对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用，目前较少有文献报道。该研究选用LMWH之一的达肝素钠进行相关研究。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器A549细胞(兰州大学医学院实验中心冻存)。CO2细胞培养箱(Biorad公司);超净工作台(CleanBlench公司);全自动酶标仪(Biorad公司)。RPMI1640培养基(Gibco);达肝素钠(Fragmin)。

1.2实验方法

1.2.1MTT法检测细胞活性将培养的A549细胞用胰酶消化，调整细胞浓度,培养24h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI1640培养基，继续培养。实验结束前4h,加入MTT，继续培养。4h后弃去培养基，加入DMSO，避光振荡10min。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(OD)。

1.2.2PI染色法检测细胞周期分布将培养的A549细胞用0.25%的胰酶消化，传代到6孔板的各孔中，培养24h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI1640培养基，继续培养。在设定的时间点按组收集细胞。收集的细胞以预冷PBS洗涤2次。离心5min，弃上清。加入含0.5%PI和0.01%RNase染液，重悬细胞，室温避光反应30min。1h内流式细胞仪检测，在488nm激发波长下测定DNA含量，分析细胞周期的分布情况。

1.3统计学分析数据以x±s表示，SPSS11.0统计软件分析,两组间比较用t检验。

2结果

2.1达肝素钠对A549细胞细胞活性的影响用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在4个时间点(6、12、24和36h)检测细胞活性。达肝素钠能降低A549细胞活性，而且这种作用表现出时间和浓度依赖性。在不含达肝素钠的培养基中培育的细胞，其12h和24h的细胞活性基本一致，但24h的细胞活性明显下降，这种下降是由培养基营养成分的耗竭所致，故24h以前的细胞活性值较能准确反应药物对细胞的影响。该数据还显示，用高浓度的达肝素钠(100和500IU/ml)培养细胞24h后，A549细胞活性大部分被抑制，但这种抑制可能与药物的毒性作用有关。50IU/ml达肝素钠在干预细胞生长24h后能抑制大约50%的细胞活性。为避免培养基成分的变化和药物毒性作用对实验结果的干扰，在随后的试验中，选择50IU/ml达肝素钠为干预浓度，测定干预24h后的各项指标。见图1。图1达肝素钠对肺腺癌A549细胞细胞活性的影响

2.2达肝素钠对A549细胞细胞周期的影响为观察达肝素钠对A549细胞周期进展的影响，将经过24h普通培养的A549细胞继续在含有50IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育

的细胞作为对照组，将两组细胞24h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期的分布。流式细胞分析显示达肝素钠抑制细胞周期的进展。与对照组相比，实验组细胞在G1期比率显著增加〔(75.7±2.1)%、(54.8±1.9)%;P0.05〕，在S期比率明显降低〔(11.3±1.96)%、(32.1±1.5)%;P0.05〕。处于G2/M期的细胞比率虽有增加，但这种差异与对照组比较没有统计学意义〔(9.2±1.1)%、(11.3±2.1)%;P>0.05〕。

3讨论

临床观察发现，以UFH和LMWH为主的抗凝治疗能改善小细胞肺癌(SCLC)的预后〔4〕。在385例进展期的实体瘤患者上进行的FAMOUS(thefragminadvancedmalignancyoutcomestudy)表明，皮下注射LMWH1年后患者生存率增加5%;患者中位生存率由对照组24.3个月增加到试验组的43.5个月〔5〕。Klerk等进行的MALT(malignancyandlow molecular weightheparintherapy)是在具有恶性肿瘤但没有静脉血栓栓塞的302例患者上进行的另外一项试验，其基本结果与FAMOUS类似〔6〕。研究还发现，LMWH能增强化疗药物的作用〔7〕。另外，LMWH在肿瘤治疗上表现出的良好作用不只与其抗凝作用有关〔8〕。

对于不同种类的细胞、不同状态的细胞，对不同种类的肝素可能表现不同的反应。文献表明，脱离静止状态的血管SMC对肝素的敏感性是处于指数增长的细胞的50到100倍〔9〕;但Mason等研究发现指数增殖状态的人奇静脉SMC对肝素的反应比静止的更明显〔10〕。