血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定

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血清丙氨酸实验报告

一、实验目的1. 了解血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）在肝脏代谢过程中的作用。

2. 掌握血清ALT活性测定的原理和方法。

3. 学会运用分光光度法测定血清ALT活性。

4. 分析血清ALT活性与肝脏疾病之间的关系。

二、实验原理血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）是一种存在于肝脏细胞内的酶，主要催化丙氨酸和α-酮戊二酸之间的氨基转移反应。

当肝脏受到损伤时，ALT会大量释放到血液中，因此，血清ALT活性的测定对肝脏疾病的诊断具有重要意义。

本实验采用分光光度法测定血清ALT活性。

在实验中，ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和谷氨酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，该化合物在碱性条件下呈现棕色，可通过分光光度法测定其在特定波长下的吸光度，从而计算出ALT的活性。

三、实验材料1. 血清样本：取适量血清样本，置于冰浴中保存。

2. 试剂：丙氨酸、α-酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠等。

3. 仪器：分光光度计、移液器、试管、试管架等。

四、实验步骤1. 标准曲线的制作：分别配制不同浓度的丙酮酸溶液，加入2，4-二硝基苯肼和氢氧化钠，测定其在特定波长下的吸光度，绘制标准曲线。

2. 血清ALT活性的测定：取血清样本，加入丙氨酸、α-酮戊二酸、磷酸盐缓冲液和2，4-二硝基苯肼，混匀后置于37℃水浴中反应一段时间。

反应结束后，加入氢氧化钠终止反应，测定其在特定波长下的吸光度，根据标准曲线计算ALT的活性。

3. 结果记录与分析：记录实验数据，计算ALT的活性，分析ALT活性与肝脏疾病之间的关系。

五、实验结果1. 标准曲线的制作：绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0058x-0.0035，R²=0.998。

2. 血清ALT活性的测定：测定血清样本的ALT活性为540 U/L。

3. 结果分析：根据文献报道，ALT活性在正常范围内为0-40 U/L。

本实验中血清样本的ALT活性为540 U/L，明显高于正常范围，提示可能存在肝脏疾病。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定方法操作规程

包头文治医院- 1 -丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（IFCC法）【预期用途】该试剂盒采用IFCC法，用于体外定量测定人血清或肝素血浆中丙氨酸氨基转移酶的活力。

【检验原理】在ALT催化下，从丙氨酸转移到2个氨基到α-酮戊二酸上，生成产物谷氨酸和丙酮酸。

后者通过乳酸脱氢酶催化下转变成乳酸，在340nm波长条件下检测到NADH吸光度下降速率，与ALT的活力成比例。

L-丙氨酸+α-酮戊二酸ALT丙酮酸+ L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+LDH L-乳酸+NAD++H2O【主要组成成份】R1：Tris缓冲液150mmol/L L-丙氨酸750 mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH） 1200U/LNADH 0.4mmol/LR2：α-酮戊二酸90mmol/L NADH 0.9mmol/L *不同批号试剂盒各组分请勿混用。

【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2℃~8℃保存有效期为一年。

试剂开瓶后应避光保存，在2℃~8℃可稳定28天。

试剂不可冰冻。

【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪。

若需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。

建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。

【样本要求】新鲜血清或肝素血浆样本，采集后及时测定，应避免污染。

【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件波长340nm 温度37℃分析类型动力学法反应方向下降反应操作步骤空白/校准/样本10ul R1200ul混匀，37℃孵育5min；R250ul 混匀，37℃孵育1min后，连续测定3min内的吸光度，计算吸光度变化率（ΔA/min）。

实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定

（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值，对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作；熟悉ALT标准曲线的绘制；熟悉酶活力概念；了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30

血清丙氨酸氨基转移酶测定

血清丙氨酸氨基转移酶测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。

2 实验原理本试剂以国际临床化学会(IFCC)推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。

⑴样本中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化丙氨酸的氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L谷氨酸。

⑵丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）还原为L-乳酸的同时还原型辅酶I（NADH+ H+）被氧化为辅酶I（NAD+），而使波长340nm处的吸光度值下降。

通过对波长340nm处吸光度值的下降速率进行监测，即可测得样本中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性。

(3)样本中内源性丙酮酸的干扰，可由试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）在测定的延迟时间内快速、完全地消除，不会对测定产生干扰。

ALTL-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + L-谷LDH（乳酸脱氢酶）氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸 + NAD+ + H2O3 标本3.1病人准备：12小时禁食。

3.2 类型：血清。

3.3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。

3.4 标本运输：常温条件下保存运输。

3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。

4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALT试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1 L丙氨酸 600mmol/L 乳酸脱氢酶＞1820U/L（R1）：NADH 0.26mmol/LTris缓冲液 80mmol/L试剂2（R2）：Tris缓冲液80mmol/L α氧代戊二酸36mmol/LEDTA 5.0mmol/4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自生产之日起有效期为12个月。

4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

血清丙氨酸氨基转移酶测定

血清丙氨酸氨基转移酶测定1.实验原理国际临床化学学会(IFCC)推荐的紫外连续监测法。

ALTL-丙氨酸+ -酮戊二酸丙酮LDH（乳酸脱氢酶）酸+ L-谷氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸+ NAD++ H2O 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与`样品中ALT的活力成正比,在340nm处NADH呈现特性吸收峰，而NAD+则没有。

因此，可在340nm监测吸光度的下降速率（-△A/min）,计算出ALT的活性单位。

2. 标本：2.1 病人准备：12小时禁食。

2.2 类型：血清，肝素或EDTA血浆。

3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。

4. 标本运输：常温条件下保存运输。

5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。

6. 实验材料6.1 试剂欧泰克ALT测定试剂盒6.1.1 试剂组成Tris缓冲液pH 7.4 80mmol/LL-丙氨酸800mmol/LLDH（乳酸脱氢酶）≥1200U/La-酮戊二酸18mmol/LNADH 0.18mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。

不可入口！避免接触皮肤及粘膜。

应采取必要的预防措施使用试剂。

6.2 校准品：使用罗氏公司提供的校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。

6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。

7. 仪器：日立7060生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页一、实验目的1. 掌握测定血清ALT活力的方法和原理。

2. 熟悉ALT在肝脏功能监测中的重要性。

二、实验原理ALT是一种酶，分布在人体的细胞内，主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等组织中。

正常情况下，ALT主要在肝脏中发挥作用。

当肝脏受到损伤时，ALT会释放到血液中，导致血液中ALT活力的升高。

因此，测定血清ALT活力是一种常用的肝功能检测方法。

本实验使用比色法测定血清ALT活力。

利用谷草-丙氨酸转移酶测定(AST)所产生的谷草酸，和血清ALT催化产生的丙酮酸反应，生成2,4-二硝基苯胺，其吸光度与丙酮酸的浓度成正比。

由此计算出血清ALT活力。

三、实验步骤1. 将标准品和待测血清样品准备好，室温恢复至20-25°C。

2. 取比色管，在无菌条件下加入以下试剂：2.5ml缓冲液pH7.5、0.25ml 10mmol/L 肌酸盐缓冲液、0.2ml5.5mmol/LNADH、0.2ml2mol/L丙酮酸、0.1ml3%的PEG，混匀。

3. 加入待测血清样品1ml，立即混匀。

4. 马上读测吸光度(Zero)。

5. 在37℃恒温箱中孵育10分钟。

6. 然后再读一次吸光度。

7. 加入ALT试剂，混匀，孵育60秒钟。

8. 反应结束后7分钟内，读取吸光度值，记录。

9. 将标准品同样操作，测定吸光度，计算样品中ALT活力的单位(L_0.9)四、实验注意事项1. 实验中的所有仪器、试剂、杯器等都要事先清洗干净，确保无污染。

2. 实验操作应在干燥、无尘、无异味的净化房间内进行。

3. 操作过程中要注意保持常温。

4. 实验中的吸光度必须在规定时间内完成测定，避免影响结果。

5. 测定前，必须保证血清样品无血浆外渗。

6. 测定期间谨慎操作，防止试剂泼溅，注意安全。

五、实验结果分析ALT活性测定值与肝损伤的程度有一定的相关性。

当ALT活性超过健康人参考范围时，说明肝脏功能出现异常，可能出现肝炎、脂肪肝等肝病状况。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定

比色法的基本原理

朗伯-比尔定律: A=KLC 即吸光度A与溶液的浓度C和溶液的厚度L的乘积成正比关系。在其他条件相同时，溶液的浓度越大或是厚度越大，则溶液对光的吸收越强（光密度越大），而透光度则越小。
比色法的基本原理

当一束单色光通过同一有色溶液的两种不同浓度的溶液时，可得出下列两式：标准管：A标=KC标L 测定管：A测＝KC测L 则
C测=A测/A标 ×C标
实验原理
谷丙转氨酶 ALT
α- 酮戊二酸二硝基苯腙(干扰)
实验操作
取试管4支，按下表加入试剂：
静置10分钟，在520nm 下读取各管吸光度。
计算
活力单位：1ml 血清于37℃ 条件下与底物作用30min产生2.5μg丙酮酸为一个1ALT单位。
C测(ug/ml )=
A测- A测空 A标- A标空
×
C标(100ug/ml)
ALT活力单位/ml=
1ml血清产生的丙酮酸ug数(C测)
2.5ug
生理意义
ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时，血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心肌炎等亦有增高。故血清谷丙转氨酶活性得测定在临床诊断上具有重要意义。
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定
目的要求

掌握ALT活性测定的基本原理; 掌握比色法的原理和分光光度计的使用方法; 了解ALT活性测定的临床意义。

比色法的基本原理
比色分析法是通过比较溶液
颜色深浅来测定物质浓度的方法。
比色法的基本原理

当一束单色光通过有色溶液时，由于溶液吸收了一部分光线，透过光的强度就减弱。透光率：T= I/ Io 吸光度(A) : A=-lgT=-lg (I/ Io) 溶液的透光率越大，说明对光的吸收越少；反之，透光率越小，说明对光的吸收越多;T值越小，A值越大。

血清丙氨酸氨基转移酶

准确。
医学ppt
14
实验试剂：
（1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙
氨酸】
（2）pH=7.4的PBS
（3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼
溶液【1 mmol/L]
(5) 0.4 mmol/L NaOH
制（作）
活力的测定标准曲线的
？
答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法
）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））
体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现
紫绀遇明火极易燃烧爆炸。干燥时
经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出
有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形
成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】
医学一pp氧t 化碳、二氧化碳、氮氧化物
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α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响
卡氏测定ALT活力的原理
答：丙氨酸+ α-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
医学ppt
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小结：区别与联系
医学ppt
9
实验原理：
医学ppt
10
知识链接：
• 转氨基作用
是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨
基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨

血清丙氨酸氨基转

• 生成的丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙
酮酸-2,4二硝基苯腙。此化合物在碱性溶液中呈
现棕色，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的
生成量，即ALT的活性高低呈正比关系。用比色
法测。
• 改良的穆氏法(Mohun)规定每毫升血清在
37℃(pH7.4)的条件下,与底物作用30分钟后, 每生成2.5μg丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
定,如不能当日操作者,可于4℃冰箱中储存1~2 天。
4、吸光度与丙酮酸的标准线成抛物线,是因
为除丙酮酸与2.4二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外,α-酮戊二酸亦能与2.4二硝基苯肼产生苯腙.这是本实验方法的缺点.
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）
活力的测定（改良穆氏法）
目的要求
1、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的基本原理。
2、熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的主要操作方法。 3、了解血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的临床意义。
实验原理
• 血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）在37℃，
pH7.4的条件下，可催化底物中的丙氨酸和α-酮戊二酸反应，生成丙酮酸和谷氨酸：
操作步骤
1、取干燥试管两支，编号，按下表操作：
将溶液混匀，静置10min。在520nm波长下比色，用对照管调节零点，读取测定管的吸光度值。然后从标准曲线中查出其相应的丙酮酸含量（μg）
丙酮酸标准曲线
2、结果计算：按下列公式计算。
丙氨酸氨基转移酶活性（U/ml）= 标准曲线中查知的微克数/2.5 ×1/0.1
临床意义
• 肝细胞ALT含量最丰富，因此肝脏疾病致
肝细胞受损时，ALT大量释放入血，引起
血中ALT显著升高。测定ALT活性是检查肝

丙氨酸氨基转移酶的测定

丙氨酸氨基转移酶的测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定主要通过肝功能检查进行，其参考值范围为0~40U/L。

在测定前，患者需要空腹12小时，不过不同年龄及人群参考范围没有明显差异。

当丙氨酸氨基转移酶数值偏高时，通常提示肝脏受到损害。

这可能是由多种原因导致的，如不良饮食习惯、过度劳累、药物因素等。

如果同时伴随肝区不适、全身乏力、食欲下降等情况，可能存在病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾病。

丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定原理是催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应。

具体来说，ALT催化丙氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸上，生成丙酮酸和NADH，然后NADH在LDH的催化下生成NAD+。

在上述偶联反应中，NADPH的氧化速率与样本中酶活性呈正比，因此可以通过检测NADPH的氧化速率来确定ALT的活性。

总的来说，丙氨酸氨基转移酶的测定对于评估肝脏功能具有重要意义。

如果检测到肝脏功能受损，建议前往医院就诊，由专业医生进行评估和治疗。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)

什么是改良赖氏法？
卡门法

赖氏法

丙酮酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙氨酸丙酮酸→NAD++乳酸在紫外分光光度法中，NADH在 340nm波长处的吸光度降低值与ALT 活性成正比。卡门氏酶单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用内径喂1.0cm的比色皿，在25摄氏度， 1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，光密度下降0.001为一个转氨酶活性单位。
临床意种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项

1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，

ALT活性的测定

一、临床意义
【参考值】：0～40U/L
ALT是丙氨酸氨基转移酶，也叫谷丙转氨酶的缩写符号。正常情况下，该酶主要存在于肝细胞内，只要极少量被释放入血浆中。当组织发生病变时，细胞内ALT被大量释放入血，引起ALT活性增高。
是诊断肝功能的主要指标之一。
ALT升高常见于：
1. 急性肝炎和中毒肝细胞坏死时显著增高。
实验器材
（1）试管
1支
（2）水浴箱
1台
（3）试管架
1个
（4）洗耳球
1个
（5）微量移液器
1支
（6）刻度吸量管（5ml） 1支
（7）半自动生化分析仪 1台
实验试剂
（1）血清（2）试剂
五、实验内容和操作过程
1、加样：取1支干净试管，加1mL试剂,10mL血清，混合均匀。
2、测定：在URIT-800半自动生化分析仪上（波长340nm）
2. 慢性肝炎、肝硬化及心肌梗死时中度增高。
3.阻塞性黄疸和胆道炎症时轻度增高。外科手术，早期妊娠时也有升高。
4. 生理性的升高如：过度劳累，剧烈运动、睡眠不好油炸食品等。
5、血清谷丙转氨酶活性测定是目前临床上诊断肝脏
疾病的一种重要方法，但不具有特异性。
二、实验目的
1．掌握测定ALT活性的原理、方法和临床意义。 2．掌握URIT-800半自动生化分析仪的使用。
三、实验原理
1. L-丙氨酸 + a-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸 2. 丙酮酸 + NADH + H+ LDH L-乳酸 + NAD+ 3. NADH的氧化速率与血清中ALT的活性成正比，
通过测定340nm处NADH的下降速率，即可计算出ALT的活性(单位：U/L)。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定

器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
2020/3/23
8
标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
二硝基苯肼溶液，氢氧化钠溶液（0.4mol/ L），丙酮酸标准液
（2.0mmol/L ）
连续监测法用试剂盒。
试剂1：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，NADH（0.2mmol/L）， LDH （＞1350U/L）；
试剂2：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，α-酮戊二酸（50mmol/L），L-丙氨酸（400mmol/L）。
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
仪器等方面的问题。
6、当血清标本酶活力超过150卡门氏单连续监测法）
L-丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+NADH
ALT 丙酮酸+L-谷氨酸
LD L-乳酸+NAD+
在340nm连续监测NADH的消耗量，从而计算出ALT的活力。
2020/3/23
7
主要试剂、材料与仪器
改良赖氏法试剂：0.1mol/ L磷酸盐缓冲液、基质缓冲液、2,4-

血清丙氨酸氨基转移酶活力的测定PPT课件

【试剂】
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼（AR）19.8mg，溶于1.0mol/L盐酸100ml，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。若有结晶析出，应重新配制。 6．0.4mol/L NaOH溶液称取NaOH 1.6g溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 7．2.0mmol/L丙酮酸标准液准确称取丙酮酸钠（AR） 22.0mg，置于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。此液不稳定，应临用前配制。丙酮酸不稳定，开封后易变质（聚合），相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。 8．待测标本病人血清或质控血清。
（以蒸馏水代替血清，其它和对照管同样操作）。所以，成批标本测定时，一般不需要每份标本都作自身血清对照管，以试剂空白管代替即可，但对超过正常值的血清标本应进行复查。严重脂血、黄疸及溶血血清可引起测定的吸光度增高；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和2，4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。
【计算】
• 测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在校正曲线上查得ALT的卡门氏单位
【参考范围】
•
血清ALT：5～25卡门氏单位
临床意义
ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。当肝脏受损时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断肝脏受损指标。
【操作步骤】
1 . 标准曲线的绘制：取试管5支，按表操作。
编号
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷
0.10

实验七血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定

实验七血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定生化实验生化实验释的丙酮酸标准液(500μg/ml)0.1ml,再按下表操作。

各管混匀，于室温静置10分钟，520nm波长，以第11管为空白管比色，读取各管光密度将各管丙酮酸含量（5－50μg）按下式换算成谷丙转氨酶活力单位: 以每100ml血清中丙氨酸氨基转移酶活力单位为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。

2．酶活性的测定取干燥洁净试管2支，标明测定管和对照管，按下表操作。

混匀，静置10min，用分光光度计，在520nm波长，用蒸馏水调节零点，读取测定管和对照管光密度，以测定管光密度值减去对照管光密度值，然后从标准曲线上查出其酶的活力单位。

【注意事项】1．标本应空腹取血，当时进行测定或将分离的血清贮存于冰箱中。

2．酶的测定结果与酶作用时间、温度、PH及试剂加入量等有关，在操作时均应准确掌握。

3．测定试剂更换时，要重新制作标准曲线。

【临床意义】ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此酶含量最多。

肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时，血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心肌炎等亦有增高。

故血清丙氨酸氨基转移谷丙转氨酶活性得测定在临床诊断上具有重要意义。

【附注】1．酶活力的意义及测定方法研究酶促反应速度和各种因素对酶促反应速度的影响时，一般以酶的活力单位为观察指标。

酶活力是指酶催化化学反应的能力；酶活力的大小用酶活力单位表示，酶的一个国际单位为在25℃下，1分钟内催化1μmol/L底物的酶量，或是转化1微摩尔（1μmol）底物的有关基团的酶量。

测定酶活力时，常常用产物的生成量或是底物的消耗量来计算。

一般以测定产物增加量为好，因为产物从无到有，只要方法足够灵敏就可以准确测定。

2．测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的方法简介一类是分光光度法，另一类是比色法。

前者是测定酶速率的方法，需要紫外分光光度计与酶试剂。

后者有金式(King)法，穆氏（Mohum）法与赖氏（Reitman Frankel）法3种。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定

2014级12班1组201450557 陆丽霞血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定实验原理：以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，在血清丙氨酸氨基转移酶的作用下，生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小,丙氨酸能与2，4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸二硝基苯腙。

丙酮酸二硝基苯腙在碱性溶液中呈现棕色，可用比色测定。

实验步骤：1.标准曲线绘制：⑴取6支试管并编号，按表4-16操作；表4-16 标准曲线的绘制试剂对照 1 2 3 4 52mmol/L丙酮酸标准液0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25底物溶液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 PBS缓冲液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37摄氏度水浴5分钟，然后各管加入2,4—二硝基苯肼2,4——二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于ALT活力单位0 28 57 97 150 200A5200 0.059 0.107 0.167 0.208 0.249⑵将所得6支试管混匀，10min后以对照组调零，用520nm波长比色并读取吸光度；⑶以吸光度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标，绘制标准曲线2．酶活性测定：⑴取2支试管，编号，按表4-17操作：表2 ALT活力测定试剂对照测定血清——0.1PBS缓冲液0.1 ——底物溶液0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴30分钟，然后各管加入2,4——二硝基苯肼2,4—二硝基苯肼0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0A5200 0.122⑵用520nm波长比色，以对照管调零，读取测定管吸光度；实验结果:由标准曲线方程y=0.0014x，当A520=0.122，即y=0.122，故x=87那么测得ALT酶活力单位为87讨论：1．查资料得参考正常值为40单位以下，实验测得ALT酶活力单位为87，机体可能发生了肝病变。

血清丙氨酸氨基转移酶活力的测定

• 混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零，在520nm波长处比色，读取吸光度，用T管得吸光度减去C的吸光度，查标准曲线，即得到待测血清中所含ALT的酶活力。
临床意义
• ALT广泛存在于机体的各种组织中，但肝细胞中含量最多，当肝脏有病变特别是急性肝炎或肝细胞坏死时，血清中ALT的活力显著升高
实验操作 0.00 丙酮酸标准
编号 0 液/ml ALT底物试剂底物试剂 /ml 盐缓冲液（pH=7.4）） /ml 2,4-二硝基苯二硝基苯肼液/ml 肼液 0.50
1 0.05
2 0.10
3 0.15
4 0.20
0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 （1）标准曲线的绘制：取试管5支，按表操作。 0.10 0.10 0.10 0.10 0.0 0.1mol/L磷酸磷酸
0.50 混匀
0.50 置37℃水中 ℃ 5.0 57
0.50 水浴20min 水浴 5.0 97
0.50
0.4mol/L NaOH/ml 相当于ALT活相当于活力（卡门氏单位）单位）
5.0 0
5.0 28
5.0 150
实验操作
• 将上述各管混匀，室温放置10min后以蒸馏水调零，用520nm波长比色，读取各管吸光度，然后以各管吸光度减去0号管的吸光度之差（An-Ao）为纵坐标，各管相应的转氨酶活力单位为横坐标，绘制标准曲线 • 取试管2只（标明测定管和对照管），将测定前将底物液在37℃水浴中预温5min，再按下表操作
丙酮酸 + 2,4 - 二硝基苯胫 → 丙酮酸 - 2,4 - 二硝基苯腙 + H 2 O
OH —
• 丙酮酸-2,4-二硝基苯腙在碱性环境中呈现红棕色，颜色的深浅与丙酮酸含量成正比，与标准丙酮酸的显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。 • α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯腙结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在520nm比色时，丙酮酸-2,4-二硝基苯腙的吸光度值远较α-酮戊二酸苯腙高。反应30min后，α-酮戊二酸量减少而丙酮酸量增高，在一定范围内，520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的物质的量之比呈线性关系。

实验六血清ALT活性测定1

实验六血清ALT活性测定
复习：
一、何谓ALT？谷丙转氨酶
（glutamic pyruvic transaminase，GPT）丙氨酸氨基转移酶
（alanine aminotransferase，ALT）
二、ALT催化的化学反应:
反应式
大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。
波长505 nm处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度；
各管读数均减去0号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性单位作图即成标准曲线。
六、结果分析：
正常参考值：5～25卡门氏单位
七、注意事项：
1．一般血清标本内源性酮酸很少，血清对照管吸光度读数接近试剂空白管 ( 以 0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空白管代替即可。但建议对超过正常的标本进行复查，复查时每份标本应作对照管。
3、标准曲线的绘制：
管号
0
磷酸盐缓冲液（ml） 0.10
丙酮酸标准液（ml） —
基质缓冲液（ml）
0.50
相当于酶活性（卡门氏单位） —
1 0.10 0.05 0.45 28
2 0.10 0.10 0.40 57
3 0.10 0.15 0.35 97
4 0.10 0.20 0.30 150
各管加 2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37℃水浴 20min；各管加 0.4 mol/L NaOH溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min。
丙氨酸 +α -酮戊二酸
丙酮酸 + 谷氨酸
基质液
丙酮酸 α-酮戊二酸
+ 2,4 二硝基苯肼

血清转移实验报告

一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义。

2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。

二、实验原理丙氨酸氨基转移酶（ALT）是一种生物体内广泛存在的氨基移换酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基互换。

在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

ALT的最适pH接近中性，其种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活力最强。

当发生肝炎、心肌梗死等病患时，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上ALT活力的测定有重要意义。

本实验采用分光光度法测定ALT活力，通过测定丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。

三、实验材料与仪器1. 材料：丙氨酸、α-酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、氢氧化钠、血清样品等。

2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 标准曲线的制作：取一系列试管，分别加入不同浓度的丙氨酸溶液，然后加入α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼，混匀后置于37℃恒温水浴锅中反应30min。

取出后加入氢氧化钠终止反应，以丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量为纵坐标，丙氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：取一系列试管，分别加入不同浓度的血清样品，然后按照标准曲线的制作步骤进行操作。

3. 数据处理：将样品测定的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量代入标准曲线，计算ALT活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：通过绘制标准曲线，得到丙氨酸浓度与丙酮酸2，4-二硝基苯腙生成量的线性关系。

2. 样品测定：根据标准曲线，计算得到血清样品中ALT的活力。

六、实验结论通过本次实验，我们成功掌握了血清ALT活力的测定方法。

实验结果表明，ALT活力在肝炎、心肌梗死等病患中显著增加，为临床诊断提供了重要依据。

七、实验注意事项1. 操作过程中要严格控制反应时间，避免过度反应。