第二章 微生物发酵制药技术

与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成
抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等
结构常较复杂对环境条件敏感
4、微生物转化发酵
利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的
特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧
或切断支链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、
结构位置特异性、立体特异性。 如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物
第三节 发酵工艺条件的确定
发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
发酵设备——发酵罐
发酵罐的特点
轴封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度
搅拌通风装置保证气液充分混合
具有足够的冷却面积
死角少，灭菌彻底
适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）
创新霉素分子结构
真菌之根霉属(Rhizopus)
• 生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。
真菌之曲霉属(Aspergillus)
• 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进 行甾体转化。
真菌之青霉属(Penicillum)
• 产黄青霉(Penicillum chrysogenum)
生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄 糖酸、柠檬酸和抗坏血酸
真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)
• 产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、
• 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C
真菌之酵母菌属(Saccharomyces)
啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤 酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞 色素C、凝血质和辅酶A等。 红酵母 (Rhodotorula)：β-胡萝卜素 棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
影响培养基质量的因素 • 原材料质量的影响 • 水质的影响 • 灭菌的影响 • pH的影响 • 其他影响因素
灭菌操作技术
• • • • • 工业生产中常用的灭菌方法： 化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质除菌 热灭菌：包括干热灭菌和湿热灭菌
产链霉素
产金霉素 产红霉素 产土霉素
放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)
• 生产利福霉素、蚊霉素等
放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora)
• 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora) 产庆大霉素。
放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）
• 典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)
第一阶段
• 1676年制成第一台显微镜 ——微生物的存在 • 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起 的 • 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒 精——酶
第二阶段
• 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于
厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳
酸和各种发酵食品。
第三阶段
原生质体融合
基因工程
从自然界中获得新菌种
土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端
环境等 基本程序： • 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型
菌株
诱变育种
物理或化学方法诱发突变
物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等
化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等
杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传
抑制细胞壁合成药
抗生素 影响细胞膜功能药 维生素 氨基酸 干扰蛋白质合成药 核苷酸 抑制核酸合成药 甾体激素 抑制生物能量反应药 酶及酶抑制剂
第二节 制药微生物 与产物的生物合成
一、常见的制药用微生物
• 细菌
• 放线菌 • 真菌
细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)
• 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 • 基因工程的载体
第二章 微生物发 酵制药技术
第一节 概述
一、微生物发酵制药的发展简史
自然发酵时期 纯培养技术时期 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期 微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时 期
发酵工程的4个阶段
保藏期 1-6个月 1-2年
砂土管保藏法
1-10年
麸皮保藏法 甘油悬液保藏法
1年 1年/10年
冷冻真空干燥保藏法
用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机
各类微生物
5-15年
液氮超低温保藏法
保护剂，超低温（各类微生物 196℃），需超低温液氮 设备 与培养基混合直接低温 保存 专性活细胞寄生微生物（如 病毒）
可的松（Cortisone）
学名：11-脱氢-17-羟皮质酮。由皮质醇分子C-11上 的羟基氧化为酮基而得的一种糖皮质素。给药后在 体内转变为皮质醇而发挥其强抗炎性。
四、微生物发酵药物的分类
生物来源 作用对象 作用机制 化学结构
细菌 真菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
工程菌和新型微生物的开发
• 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、
白介素促红细胞生成素等；
• 新型菌体制剂和疫苗。
红细胞生成素
生长激素 胰岛素 干扰素
( 治疗贫血)
( 促进生长) (治疗糖尿病) (抗病毒、抗肿瘤)
二、微生物发酵制药研究的内容
• 利用微生物技术，通过高度工程化的新 型综合技术，以利用微生物反应过程为基 础，依赖于微生物机体在反应器内的生长 繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分 离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来 实现药物产品的生产。
真菌之其它
牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、 胆碱和腐胺等生物碱。 灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其 中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、
香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量
元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。
二、制药微生物菌种的选育
发酵罐的类型
• 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统
• 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium）
培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、前体物、 促进剂、抑制剂
培养基的类型
按组成
按形态
按用途
合成培养基 （用于科学研究） 复合培养基 （用于工业生产）
• 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素 迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、 核酸发酵成功。
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合 技术等高新技术应用阶段。
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法
主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温 或4℃保藏 沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4℃保 藏 麸皮作载体，干燥，4℃ 保藏 悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱
适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法 基因工程菌
15年以上
宿主保藏法
菌种保藏机构
• ＡＴＣＣ中国微生物菌种资源库 • ＣＣＣＣＭ中国微生物菌种保藏管理委员会 • ＮＣＴＣ国家标准菌库,全国典型菌种收集委 员会
四、微生物代谢产物的生物合成
（一）微生物合成的初级代谢产物 （二）微生物次级代谢产物的生物合成 基本特征： 1、次级代谢产物具有种特异性 2、分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期：菌 体生长期、产物合成期以及菌体自溶期 3、次级代谢产物不少是结构相似的混合物 4、次级代谢产物的合成受多基因控制
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化
安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
发酵菌种的选育方法
从自然界中获得新菌种 诱变育种 杂交育种
发酵工程制药的特点
• 微生物菌种选育获得高产
• 发酵的理论产量存在约10%的变量
• 发酵过程常温常压，操作条件温和
• 纯种培养、无菌条件
• 生产过程是以生物体的自动调节方式进行的
• 分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段
• 投资少、见效快
发展趋势
• 利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的
三、微生物发酵药物的来源
1、微生物菌体的发酵
SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）
生物防治制剂（如苏云金杆菌）
活性乳制剂
细胞的生长与产物的积累成平行关系，
生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段
单细胞蛋白质的优点 ①生长繁殖迅速：生产能力可达2～6kg/（m3.h）。 ②不受外界条件的影响，可以人工控制工业化生产。 ③营养价值高：微生物细胞内蛋白质含量（占细胞 干物质）： 细菌 60～80％， 小球藻和螺旋蓝细菌50～65％ 酵母菌40～55％， 霉菌20～50％ 大豆35～40％, 小麦10～12％，牛肉18～22％ 此外这些微生物细胞中还含有丰富的碳水化合物和 维生素、麦角甾醇、矿物质、各种酶和未知生长 因子
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
三、制药微生物菌种的保藏 (Culture conservation)
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
菌种保藏三要素
典型菌种的优良纯种的休眠体；
创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、 避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。
菌种保藏的常用方法
斜面低温保藏法
石蜡油封存法
砂土管保藏法
麸皮保藏法
甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
培养基和发酵设备的灭菌方法： 实罐灭菌（实消） 空罐灭菌（空消） 连续灭菌（连消） 过滤器及管道灭菌
无菌检查与染菌处理
无菌检查： 无菌试验、发酵液直接镜检和发酵液生化分析 染菌的判断：以无菌试验中的酚红肉汤培养基和 双碟培养的反应为主，以镜检为辅。 染菌防治技术： 污染杂菌 污染噬菌体
• 生产抗癌类药物
放线菌
• 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济 价值大。
放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces )
灰色链霉菌(Streptomyces griseus)
金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
• 生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用 于甾体转化等。
细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas)
• 生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类； • 进行类固醇（甾体）转化； • 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus)
细菌之短杆菌属(Brevibacterium)
• 维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的
菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
来自百度文库
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
• 生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
• 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，
• 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
2、微生物酶发酵
各种酶制剂 糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌
纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓
青霉素酰化酶：青霉素生产
需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种
选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。
3、微生物代谢产物发酵
初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物：