第二章 微生物发酵制药技术
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微生物发酵制药(下)
发酵制药
培养技术
4．连续式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中， 不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的 发酵液，直至发酵结束。 特点： 恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的组成将不 随时间而变。 培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获；提高菌体 密度；自动化。 缺点：时间长，杂菌污染、突变机会增多。
第二章 微生物发酵制药工艺
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 微生物发酵与制药 微生物生长与生产的关系 制药微生物生产菌种建立 培养基制备 灭菌工艺
2.5
灭菌工艺
灭菌方法与原理 培养基灭菌工艺 空气除菌工艺
发酵制药
灭菌工艺
几个概念
杂菌：除生产菌以外的任何微生物。 污染：感染杂菌的培养或发酵体系。 消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化 程度，杀灭率99.9%以上。 杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微 生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。 灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。
发酵制药
培养技术
5、灌流（注）式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培 养过程中，不断补充新培养基，取出部分条 件培养基，菌体仍然滞留罐内。 特点： 除去有毒害的代谢物 补充营养物质
发酵制药
培养技术
小结
发酵培养的基本过程 培养技术:概念与特点 操作方式：区别，特点
发酵制药
培养技术
思考题
（1）如何种子罐级数确定？ （2）深层培养、固定化培养、高密度培养有何 特点？ （2）各种操作方式的异同点，如何选择应用？
发酵制药
培养技术
2.6.3 发酵培养的操作方式
1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作 2、流加式操作，补料－分批式操作 3、半连续式操作，反复分批式或换液培养 4、连续式操作，衡态操作 5、灌流式操作
生物技术制药 第二章 发酵工程 ppt课件
甘油悬液法：基因工程菌
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50
冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以 在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株 无需进行冷冻保藏，便于运输
液氮法：最为有效，保藏15年以上， 宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物
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51
第三节、发酵设备及消毒灭菌
一、发酵设备
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43
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错位PCR
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45
基本步骤
(1)用DNase I消化功能 相同的一组基因片段(A)， 从而产生随机小片段(B)。
(2)经提纯后，用无引物(经变 性后可互为引物)的类似PCR反 应重新装配这些小片段成完整 长度的重组基因片段(C)，在 装记过程中被证明有低水平点 突变产生。
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27
（二）放线菌
产抗生素最多的一类微生物 另外生产B12,酶，甾体转化 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的
代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素；四 环素；红霉素等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
链霉菌
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（三）真菌
抗生素 维生素 酶制剂 有机酸等 药用真菌（大型真菌）
5
(二)发酵工业
定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无 机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。
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6
(1)传统生物技术
发酵食品 有机酸 氨基酸 核酸类物质 酶制剂 医药工业（抗生素…） 饲料工业（单细胞蛋白 环境工程（废物处理） 其它 （冶金工业…）
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第二章 微生物发酵制药技术
三、微生物发酵药物的来源
1、微生物菌体的发酵
SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）
生物防治制剂（如苏云金杆菌）
活性乳制剂
细胞的生长与产物的积累成平行关系，
生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段
单细胞蛋白质的优点 ①生长繁殖迅速：生产能力可达2～6kg/（m3.h）。 ②不受外界条件的影响，可以人工控制工业化生产。 ③营养价值高：微生物细胞内蛋白质含量（占细胞 干物质）： 细菌 60～80％， 小球藻和螺旋蓝细菌50～65％ 酵母菌40～55％， 霉菌20～50％ 大豆35～40％, 小麦10～12％，牛肉18～22％ 此外这些微生物细胞中还含有丰富的碳水化合物和 维生素、麦角甾醇、矿物质、各种酶和未知生长 因子
第二章 微生物发 酵制药技术
第一节 概述
一、微生物发酵制药的发展简史
自然发酵时期 纯培养技术时期 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期 微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时 期
发酵工程的4个阶段
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
三、制药微生物菌种的保藏 (Culture conservation)
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
第2章微生物发酵制药工程-4
• Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发- Q显-Q辐射 • 发酵是一个复杂的生化过程，底物和生成物很多， 但是发酵热的计算以主要的物质即在反应中起决定 作用的物质来近似计算。
发酵过程温度的控制
• 最适发酵温度的选择—变温发酵 • 在生产上，为了使发酵温度控制在一定的范围，常 在发酵设备上装有热交换设备，例如采用夹套、排 管或蛇管进行调温，冬季发酵时空气还需要进行加 热。
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止 杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工 作内容。尤其是无菌程度要求高的液体 深层发酵，污染防止工作的重要性更为 突出。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂 菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量 或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至 停产。
染菌的具体危害：
1）分解产物 2）污染产品 3）抑制生产菌的生长和代谢的产生 4）影响产物的提取率
无菌室内无菌度的要求
• 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂 的经验，长出的菌落在3个以下为好。
对种子培养基染菌的处理
• 一般均应灭菌后坚决弃去，并对接触过的设备，管道全部灭菌， 加长灭菌时间等。
六、空气带菌及其控制
• 空气过滤器效能下降：过滤介质松动、老化、吸潮 • 肉汤平板检测无菌空气质量 • 通过定期检查管件，更换过滤介质和加强检修
• 为了获得最高的生产率，须要采用摄氧速率与传氧 速率相平衡时菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变
化的曲线和摄氧速率随菌浓变化曲线的交点所对应
的菌体浓度，这就是临界菌体浓度。菌体超过此浓 度，抗生素的比合成率和体积产率都会迅速下降。
菌体浓度的控制
• 发酵过程中要把菌体浓度控制在适宜的范围之内， 主要靠： 1. 调节基质浓度； 2. 采用中间补料，控制CO2和O2量； 3. 若生长缓慢，菌体浓度低时，可补加磷酸盐，促 进生长。
微生物发酵制药
次级代谢产物：是比较复杂的化合物，不是细胞 生长必需的，对生命有意义（抗逆境条件）。抗 生物、毒素、色素。
整理课件
3
发酵罐发酵
整理课件
4
摇床发酵
立式
卧式
整理课件
5
静置发酵
整理课件
6
发酵制药
利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵、代谢 合成药物，然后从中提取、精制纯化，获得药 品的过程。
整理课件
的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反
应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子
转移造成的损伤。离子注入生物学效应显示出一些不
同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者
相结合的复合诱变效应
（2）激光辐射诱变和微波电整理磁课件辐射诱变
整理课件
17
二、制药微生物菌种的选育
1、选育的目的
改善菌种的特性，使产量提高，改进质 量、降低成本、改革工艺、方便管理及综 合利用等
2、选育的方法：
A、自然选育；
B、诱变育种
C、杂交育种
整理课件
18
自然选育
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变 而进行的菌种筛选过程。
应用： 1）菌种的纯化 2）菌株的复壮。 2）选育高产菌株
菌体自溶期（cell autolysis phase)
整理课件
10
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延 滞期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，整理Βιβλιοθήκη 件22诱变方案设计
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发酵罐发酵
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摇床发酵
立式
卧式
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静置发酵
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发酵制药
利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵、代谢 合成药物，然后从中提取、精制纯化，获得药 品的过程。
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的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反
应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子
转移造成的损伤。离子注入生物学效应显示出一些不
同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者
相结合的复合诱变效应
（2）激光辐射诱变和微波电整理磁课件辐射诱变
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二、制药微生物菌种的选育
1、选育的目的
改善菌种的特性，使产量提高，改进质 量、降低成本、改革工艺、方便管理及综 合利用等
2、选育的方法：
A、自然选育；
B、诱变育种
C、杂交育种
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自然选育
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变 而进行的菌种筛选过程。
应用： 1）菌种的纯化 2）菌株的复壮。 2）选育高产菌株
菌体自溶期（cell autolysis phase)
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发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延 滞期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，整理Βιβλιοθήκη 件22诱变方案设计
生物制药学——第二章 生物制药工艺学基础
原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、 粉剂等供临床应用的各种剂型。
一、生物材料与生化活性物质
（一）生物制药的生物材料来源
生物资源：主要有动物、植物、微生物的组织、器 官、细胞与代谢产物。
开发新途径： 动植物细胞培养、微生物发酵、 基因工程、细胞工程、酶工程等。
一、生物材料与生化活性物质
红霉素 杀念珠菌素 Bialaphos FK506
（约8700种）
放线菌产生的多种多样的次生代谢产物
Hygromycin B
Kanamycin B
Rifamycin SV
Cephamycin C
Erythromycin streptomycin
Spinosyn A
Abamectin
Validamycin A
人源性生化药物 动物生化药物 植物生化药物 微生物源生化药物 海洋生物生化药物
生化制药的六个阶段：
1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎 3.提取：
从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。 4.纯化：
粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、超 离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。 5.浓缩、干燥及保存 6.制剂：
生化成分：氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、 脂类、维生素等。
新的有效生物药物逐年增加：天花粉蛋白、木瓜 蛋白酶、天麻多糖等。
5、微生物—细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主 要发展领域有： （1）氨基酸：
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸产生 氨基酸。 （2）有机酸：柠檬酸、苹果酸、乳酸
生物材料来源
1、动物脏器 2、血液、分泌物和其他代谢产物 3、海洋生物 4、植物 5、微生物
一、生物材料与生化活性物质
（一）生物制药的生物材料来源
生物资源：主要有动物、植物、微生物的组织、器 官、细胞与代谢产物。
开发新途径： 动植物细胞培养、微生物发酵、 基因工程、细胞工程、酶工程等。
一、生物材料与生化活性物质
红霉素 杀念珠菌素 Bialaphos FK506
（约8700种）
放线菌产生的多种多样的次生代谢产物
Hygromycin B
Kanamycin B
Rifamycin SV
Cephamycin C
Erythromycin streptomycin
Spinosyn A
Abamectin
Validamycin A
人源性生化药物 动物生化药物 植物生化药物 微生物源生化药物 海洋生物生化药物
生化制药的六个阶段：
1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎 3.提取：
从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。 4.纯化：
粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、超 离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。 5.浓缩、干燥及保存 6.制剂：
生化成分：氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、 脂类、维生素等。
新的有效生物药物逐年增加：天花粉蛋白、木瓜 蛋白酶、天麻多糖等。
5、微生物—细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主 要发展领域有： （1）氨基酸：
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸产生 氨基酸。 （2）有机酸：柠檬酸、苹果酸、乳酸
生物材料来源
1、动物脏器 2、血液、分泌物和其他代谢产物 3、海洋生物 4、植物 5、微生物
第二章 微生物发酵制药技术
• 不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 空白 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 玉米粉
酶活（u/g）
中性条件下酶活 外加碳源对产酶的影响 碱性条件下酶活
1400 1200
酶活（u/g）
1000 800 600 400 200 0
空白
• 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32 ℃ ，
• 青霉菌生长温度为30 ℃ 。
• 2、根据培养条件选择
• 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
• 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低
些，溶氧浓度也可髙些。
• 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利
用快，会使菌过早自溶。
注意：遗传特性不稳定，容易继续 变异； 需要经常进行选育工作； 能提高平均生产水平，但不 能大幅提高。
第二节 制药微生物与产物的生物合成
二、制药微生物菌种的选育
（一）自然选育
生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落
斜面种子
高产菌株
沙土管菌种
斜面种子
摇瓶复筛
高产纯化株
第二节 制药微生物与产物的生物合成
4.水 5.前体：内源性、外源性
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（二）培养基的种类与选择 1.培养基的种类 （1）孢子培养基：制备孢子 （2）种子培养基： 孢子发芽、菌体生长繁殖 （3）发酵培养基
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（三）影响培养基质量的因素 1.原材料质量的影响 2.水质的影响 3.灭菌的影响 4.pH的影响 5.其他影响因素：黏度
第一节 概 述
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 空白 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 玉米粉
酶活（u/g）
中性条件下酶活 外加碳源对产酶的影响 碱性条件下酶活
1400 1200
酶活（u/g）
1000 800 600 400 200 0
空白
• 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32 ℃ ，
• 青霉菌生长温度为30 ℃ 。
• 2、根据培养条件选择
• 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
• 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低
些，溶氧浓度也可髙些。
• 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利
用快，会使菌过早自溶。
注意：遗传特性不稳定，容易继续 变异； 需要经常进行选育工作； 能提高平均生产水平，但不 能大幅提高。
第二节 制药微生物与产物的生物合成
二、制药微生物菌种的选育
（一）自然选育
生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落
斜面种子
高产菌株
沙土管菌种
斜面种子
摇瓶复筛
高产纯化株
第二节 制药微生物与产物的生物合成
4.水 5.前体：内源性、外源性
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（二）培养基的种类与选择 1.培养基的种类 （1）孢子培养基：制备孢子 （2）种子培养基： 孢子发芽、菌体生长繁殖 （3）发酵培养基
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（三）影响培养基质量的因素 1.原材料质量的影响 2.水质的影响 3.灭菌的影响 4.pH的影响 5.其他影响因素：黏度
第一节 概 述
微生物发酵制药技术基础—培养基和设备的灭菌
K1
K `1
ln（ K 2 ） ln（ K`2 ）
K1
K `1
即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要
大于培养基成分破坏速率的增加倍数。
从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生 物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡 速率大于培养基成分破坏的速率。
不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）
缺点： • 设备较庞大； • 维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生
局部过热或灭菌不足的现象； • 喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较
多的培养基极易堵塞。
2.喷射加热器加热的连续灭菌流程
优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进 先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基 总的受热时间短，营养物质的损失不严重。
依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：
• 连消塔加热的连续灭菌流程 • 喷射加热器加热的连续灭菌流程 • 薄板换热器加热的连续灭菌流程
1.连消塔加热的连续灭菌流程
这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连 消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达 到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后 由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。
连续灭菌的优缺点
优点 • 短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失 • 操作条件恒定，灭菌质量稳定 • 易于实行管道化和自动化控制 • 避免反复加热和冷却，提高了热利用率 • 发酵设备利用率高
缺点 • 设备要求高，需另外设置加热冷却装置 • 操作比较麻烦 • 染菌机会多 • 对蒸汽要求高 • 不适合大量固体物料的灭菌
（二）对数残留定律
第2章微生物发酵制药工艺
次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长 必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生 素，毒素，色素。
2、发酵制药
概念 利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代
谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化， 获得药品的过程
抗生素的发现
1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物 质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14 种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开 始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶 段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半 合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际 生产和应用的只有100余种。
次级代谢产物生物合成的基本特征
（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含 有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯 醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、 核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、 环肽等键。
（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类 学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色 链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生 大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相 同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌 素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种 次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化 合物。
growth phase）
发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，
2、发酵制药
概念 利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代
谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化， 获得药品的过程
抗生素的发现
1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物 质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14 种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开 始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶 段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半 合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际 生产和应用的只有100余种。
次级代谢产物生物合成的基本特征
（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含 有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯 醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、 核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、 环肽等键。
（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类 学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色 链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生 大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相 同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌 素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种 次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化 合物。
growth phase）
发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，
微生物发酵制药技术
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发酵制药流程
31
发酵制药工艺
32
五、微生物发酵基本过程特征
菌体生长与产物合成的三个阶段： 发酵前期（fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase) 发酵中期(fermentation metphase) 产物合成期（product synthesis phase) 发酵后期（ fermentation anahase） 菌体自溶期（cell autolysis phase)
维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用
的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌， 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
1。稀释涂布
2。平板划线纯化
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斜面传代
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防止菌株衰退的措施
菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵 产品的得率降低. 1、衰退的可能原因 （1）、基因突变 （2）、分离现象 2、防止菌种衰退的方法 A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数 C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代; E、采用有效的菌种保藏方法
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发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。 代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，后 氨被利用。先降后升－以糖为碳源，释放出丙酮酸 等有机酸，后被利用。
微生物发酵制药工艺
合子
虽然有成功报导，但多数效果不显著。
发酵制药
生产菌种的建立
（3）原生质体融合育种
概念 通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同 种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲 本遗传性状的新细胞.
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备： 用去壁酶处理将微生 物细胞壁除去，制成 原生质体。 e.高产菌株
发酵制药
生产菌种的建立
药物的筛选
琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 靶向筛选 高通量筛选 高内涵筛选
发酵制药
生产菌种的建立
2、菌种选育——自然选育（1）
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自 然突变而进行的菌种筛选过程。 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防止退 化，稳定生产水平。1年1次。 过程 菌 种 单孢 子 平板 单菌落 优良 分离 测活 菌株 效率低, 增产幅度小
dX r= dt
比生长速率μ：单位菌体浓度的生长速率 生长速率的标准化，菌体活力大小
dX ⎛ 1 ⎞ μ= ⎜ ⎟ dt ⎝ X ⎠
发酵制药
生长与生产的关系
菌体生物量与时间的关系是S形曲线。 分为五个阶段
减速期 dX/dt =μmax X dX/dt =μ X dX/dt = (μ - kd) X = 0 dX/dt = - kd X 延滞期 指数生长期 衰亡期 静止期
发酵前期(fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase） 发酵中期(fermentation metaphase) 产物合成（生产）期(product synthesis phase) 发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
电子教案与课件：《制药工艺学(第二版)》 第2章 微生物发酵制药工艺 (2.5)_( 灭菌工艺)
kd Aexp RT
A为常数，E为死亡活化能，T为绝对温度，R为气体常数。
发酵制药
灭菌工艺
灭菌时间与比死亡速率之间的关系
t 1 ln( X 0 ) kd X
➢ kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 ➢通常：杀死芽孢的温度和时间为指标，X＝0.001。
➢确保彻底灭菌，实际操作中增加 50％ 的保险系数。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.2 培养基的灭菌操作
2.5.2.3 连续灭菌操作
➢ 优点: 采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 热能利用合理，易于自动化控制。
➢ 缺点: 发酵罐利用率低，增加了连续灭菌设备及操作
环节，增加染菌几率；对压力要求高，不小于 0.45 mPa，一般为0.45～0.8 mPa 。 ➢ 不适合: 粘度大或固形物含量高的培养基灭菌。
甚至是产品的质量。
发酵制药
灭菌工艺
制药工艺的灭菌
• 灭菌： 指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备、
空间中所有生物的技术或工艺过程。
➢发酵和细胞车间：无菌培养，培养基和空气无菌； ➢制剂车间：无菌洁净空间，设备无菌，原料无菌； ➢制药用水：无菌纯净水； ➢相关工艺：需要验证。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.1 常用灭菌方法与原理 灭菌质量要求
发酵制药
灭菌工艺
灭菌操作举例1
❖ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭 菌及管道灭菌
①从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达 0.147MPa，维持45min；
②灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过 达到死角灭菌；
③灭菌完毕，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤 器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。
A为常数，E为死亡活化能，T为绝对温度，R为气体常数。
发酵制药
灭菌工艺
灭菌时间与比死亡速率之间的关系
t 1 ln( X 0 ) kd X
➢ kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 ➢通常：杀死芽孢的温度和时间为指标，X＝0.001。
➢确保彻底灭菌，实际操作中增加 50％ 的保险系数。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.2 培养基的灭菌操作
2.5.2.3 连续灭菌操作
➢ 优点: 采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 热能利用合理，易于自动化控制。
➢ 缺点: 发酵罐利用率低，增加了连续灭菌设备及操作
环节，增加染菌几率；对压力要求高，不小于 0.45 mPa，一般为0.45～0.8 mPa 。 ➢ 不适合: 粘度大或固形物含量高的培养基灭菌。
甚至是产品的质量。
发酵制药
灭菌工艺
制药工艺的灭菌
• 灭菌： 指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备、
空间中所有生物的技术或工艺过程。
➢发酵和细胞车间：无菌培养，培养基和空气无菌； ➢制剂车间：无菌洁净空间，设备无菌，原料无菌； ➢制药用水：无菌纯净水； ➢相关工艺：需要验证。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.1 常用灭菌方法与原理 灭菌质量要求
发酵制药
灭菌工艺
灭菌操作举例1
❖ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭 菌及管道灭菌
①从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达 0.147MPa，维持45min；
②灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过 达到死角灭菌；
③灭菌完毕，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤 器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。
微生物药物的发酵生产技术
青霉素的产生菌——产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（P. notatum），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到60000U/ml。
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
微生物发酵制药技术基础—培养基的选择
发酵培养基选择
提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分 利于减少培养基原料的单耗 利于提高培养基和产物的浓度以提高生产能力 利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期 减少副产物的形成便于分离纯化 原料低廉，质量稳定，取材容易 原料减少对通气搅拌的影响，提高氧利用率，降能耗 利于产品分离纯化，减少产生三废物质
一次升温液化法过程如下：用纯碱溶液将30％～35％淀粉乳（13 ～14°Bé）调整pH至6.2～6.4，然后加入Ca2+和α-淀粉酶，搅匀 后泵入密闭的液化锅内，加热到88～90℃，保温15～20min。液 化完毕，用碘液检查，合格后，即升温至100℃，加热使酶失活 。α-淀粉酶用量为8～10U/g淀粉。反应液中Ca2+浓度为 0.01mol/L。
0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。 6.过滤除杂
酸解法
评价
优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周 转快。 缺点： •要求设备耐腐蚀、耐高温和耐压。 •副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。 •对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较 高的精制淀粉。
DE值
DE值：dextrose equivalent value （葡萄糖当量值）
根据微生物的特点选择培养基
用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、 霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要 求不尽相同，要依据微生物的不同特性，来考 虑培养基的组成。
液体和固体培养基的选择
• 发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发 酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风 培养。
• 固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌 落特征鉴定、活细胞数测定等方面。
• 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需 要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。
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与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成
抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等
结构常较复杂对环境条件敏感
4、微生物转化发酵
利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的
特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧
或切断支链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、
结构位置特异性、立体特异性。 如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物
创新霉素分子结构
真菌之根霉属(Rhizopus)
• 生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。
真菌之曲霉属(Aspergillus)
• 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进 行甾体转化。
真菌之青霉属(Penicillum)
• 产黄青霉(Penicillum chrysogenum)
生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄 糖酸、柠檬酸和抗坏血酸
保藏期 1-6个月 1-2年
砂土管保藏法
1-10年
麸皮保藏法 甘油悬液保藏法
1年 1年/10年
冷冻真空干燥保藏法
用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机
各类微生物
5-15年
液氮超低温保藏法
保护剂，超低温（各类微生物 196℃），需超低温液氮 设备 与培养基混合直接低温 保存 专性活细胞寄生微生物（如 病毒）
原生质体融合
基因工程
从自然界中获得新菌种
土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端
环境等 基本程序： • 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型
菌株
诱变育种
物理或化学方法诱发突变
物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等
化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等
杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传
2、微生物酶发酵
各种酶制剂 糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌
纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓
青霉素酰化酶：青霉素生产
需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种
选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。
3、微生物代谢产物发酵
初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物：
发酵罐的类型
• 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统
• 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium）
培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、前体物、 促进剂、抑制剂
培养基的类型
按组成
按形态
按用途
合成培养基 （用于科学研究） 复合培养基 （用于工业生产）
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法
主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温 或4℃保藏 沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4℃保 藏 麸皮作载体，干燥，4℃ 保藏 悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱
适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法 基因工程菌
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
三、制药微生物菌种的保藏 (Culture conservation)
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
影响培养基质量的因素 • 原材料质量的影响 • 水质的影响 • 灭菌的影响 • pH的影响 • 其他影响因素
灭菌操作技术
• • • • • 工业生产中常用的灭菌方法： 化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质除菌 热灭菌：包括干热灭菌和湿热灭菌
可的松（Cortisone）
学名：11-脱氢-17-羟皮质酮。由皮质醇分子C-11上 的羟基氧化为酮基而得的一种糖皮质素。给药后在 体内转变为皮质醇而发挥其强抗炎性。
四、微生物发酵药物的分类
生物来源 作用对象 作用机制 化学结构
细菌 真菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
15年以上
宿主保藏法
菌种保藏机构
• ＡＴＣＣ中国微生物菌种资源库 • ＣＣＣＣＭ中国微生物菌种保藏管理委员会 • ＮＣＴＣ国家标准菌库,全国典型菌种收集委 员会
四、微生物代谢产物的生物合成
（一）微生物合成的初级代谢产物 （二）微生物次级代谢产物的生物合成 基本特征： 1、次级代谢产物具有种特异性 2、分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期：菌 体生长期、产物合成期以及菌体自溶期 3、次级代谢产物不少是结构相似的混合物 4、次级代谢产物的合成受多基因控制
培养基和发酵设备的灭菌方法： 实罐灭菌（实消） 空罐灭菌（空消） 连续灭菌（连消） 过滤器及管道灭菌
无菌检查与染菌处理
无菌检查： 无菌试验、发酵液直接镜检和发酵液生化分析 染菌的判断：以无菌试验中的酚红肉汤培养基和 双碟培养的反应为主，以镜检为辅。 染菌防治技术： 污染杂菌 污染噬菌体
细菌之短杆菌属(Brevibacterium)
• 维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的
菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
• 生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
• 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，
• 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化
安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
发酵菌种的选育方法
从自然界中获得新菌种 诱变育种 杂交育种
产链霉素
产金霉素 产红霉素 产土霉素
放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)
• 生产利福霉素、蚊霉素等
放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora)
• 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora) 产庆大霉素。
放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）
• 典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)
抑制细胞壁合成药
抗生素 影响细胞膜功能药 维生素 氨基酸 干扰蛋白质合成药 核苷酸 抑制核酸合成药 甾体激素 抑制生物能量反应药 酶及酶抑制剂
第二节 制药微生物 与产物的生物合成
一、常见的制药用微生物
• 细菌
• 放线菌 • 真菌
细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)
• 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 • 基因工程的载体
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
• 生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用 于甾体转化等。
细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas)
• 生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类； • 进行类固醇（甾体）转化； • 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus)
• 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素 迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、 核酸发酵成功。
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合 技术等高新技术应用阶段。
• 生产抗癌类药物
放线菌
• 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济 价值大。
放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces )
灰色链霉菌(Streptomyces griseus)
金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
第一阶段
• 1676年制成第一台显微镜 ——微生物的存在 • 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起 的 • 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒 精——酶
第二阶段
• 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于
厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳
酸和各种发酵食品。
第三阶段
菌种保藏三要素
典型菌种的优良纯种的休眠体；
创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、 避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。
菌种保藏的常用方法
斜面低温保藏法
石蜡油封存法
砂土管保藏法
麸皮保藏法
甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
第二章 微生物发 酵制药技术
第一节 概述
一、微生物发酵制药的发展简史
自然发酵时期 纯培养技术时期 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期 微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时 期
发酵工程的4个阶段
工程菌和新型微生物的开发
• 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、
白介素促红细胞生成素等；