(完整版)抗氧化试验方法

一、试验方法

1、DPPH自由基清除率的测定

本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。

1.1实验原理

1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

1.2溶液的配制

0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。

1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%

公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值

A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值

A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值

将实验重复三次，求得清除率的平均值。

2、总的抗氧化活性的测定

总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。

2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。

2.2溶液的配制

样品液:同上

磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀，即得。

2.3实验步骤

分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml 离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90 min、120 min、150 min。

放冷至室温，695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。

三、还原力的测定

3.1 实验原理

以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6，再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3，由700nm处吸光

值变化检测还原力大小。吸光值愈高表示样品的还原力也就越强。

3.2 溶液的配制

3.2.1样品的配制：用乙醇配制浓度分别为0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml各样品溶液，浓度分别为0.06,0.12,0.18,0.24,0.30mg/mlBHT溶液，Vc溶液。

3.2.2 0.2mol/LPBS，PH=6.6:

A溶液:0.2mol/L Na2HPO4溶液:称Na2HPO4.2H2O35.63g，定容至1000mL;

B溶液: 0.2mol/L NaH2PO4溶液:称NaH2PO4.2H2O31.21g，定容至1000mL;

取A溶液37.5mL加B溶液62.5mL，即为pH=6.6的0.2mol/L PBS。

3.3 实验步骤

不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，加入0.2moL/L 的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，得混合物于50℃水浴保温20分钟，然后加入2.5ml10%（w/v）三氯乙酸溶液,混合溶液3000rpm 离心10min，精密吸取上清液2.5ml，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1%的三氯化铁溶液，在700nm处测吸光度（吸光度值越大，还原力越强）。BHT做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。