病原菌的分离培养和纯化
实验二植物病原菌的组织分离
实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。
二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。
期间融化培养基备用。
（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。
在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。
（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。
（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。
倒置于25—28℃恒温箱内培养。
（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
实验六 土壤中真菌纯化、分离和培养
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种 方法。
混菌法和涂抹法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
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实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发 现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同土样中各类微生物数量不同，一般土 壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 本次实验从土壤中分离真菌。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
食品中的食源性病原菌检测
食品中的食源性病原菌检测食品安全一直是人们关注的重要问题。
随着食品供应链的延长和国际贸易的增加，食品中的食源性病原菌检测变得尤为重要。
食源性病原菌是指通过食品传播给人类的一类微生物，它们可能引发食物中毒、胃肠道感染等疾病，对人体健康构成潜在威胁。
要保证食品的安全，必须在食品生产和供应环节中进行食源性病原菌的检测。
食品中的病原菌检测主要包括样品采集、分离培养、基因检测等步骤。
首先，样品采集是食品中病原菌检测的第一步。
在收集样品时，要遵循严格的卫生标准，避免交叉污染。
不同食品有不同的采样方法，例如水果和蔬菜可以通过切割表面、冲洗等方式进行采样，而肉类和乳制品需要进行真空袋封装等方法。
采集的样品应该在适当的环境条件下保存，以确保后续的检测能够准确可靠地进行。
其次，分离培养是食源性病原菌检测中的重要环节。
它通过将样品中的病原菌分离出来，并进行纯化培养，以便后续的检测和鉴定。
传统的分离培养方法包括在适当的培养基上进行培养，通过观察菌落形态、生理生化特性等来鉴定病原菌的种类。
然而，传统方法需要较长的时间，通常需要几天到几周才能获得结果，这在一些紧急情况下显得不够迅速。
随着生物技术的发展，基因检测在食源性病原菌检测中得到了广泛应用。
基因检测利用PCR或实时荧光定量PCR等方法，通过检测病原菌的核酸序列来确定其存在。
这种方法不仅速度快、准确性高，还可以同时检测多种病原菌，提高了检测效率。
此外，基因检测还可以应用于食品中的病原菌溯源，帮助追踪和控制食品安全事故。
除了样品采集、分离培养和基因检测，食源性病原菌检测还需要建立完善的质量控制体系。
质量控制包括方法验证、实验室设备校准、人员培训等环节，以确保检测结果的准确性和可靠性。
食品生产企业和监管机构应密切合作，建立检测数据的共享和交流机制，加强对食品中食源性病原菌的监测和防控，保障消费者的食品安全。
总之，食品中的食源性病原菌检测对于保障食品安全至关重要。
通过严格的样品采集、分离培养和基因检测等步骤，我们可以及时准确地检测出食品中的病原菌，保障消费者的身体健康。
病菌纯化培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握病菌纯化培养的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作技术，确保实验结果的准确性。
3. 通过实验，加深对病菌生长、繁殖特性的理解。
二、实验原理病菌纯化培养是微生物学实验中的重要环节，其目的是从混杂的微生物群体中分离出单一菌株。
通过选择合适的培养基和适当的培养条件，可以使目标病菌生长繁殖，同时抑制其他微生物的生长，从而获得纯培养。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- 病菌培养皿（平板）- 病菌接种环- 病菌培养箱- 显微镜- 病菌分离培养基- 生理盐水- 75%酒精- 灭菌棉签- 紫外线消毒灯2. 实验仪器：- 灭菌锅- 灭菌器- 高压蒸汽灭菌器- 电子天平- 移液器- 恒温水浴锅四、实验步骤1. 样品采集与处理：- 从土壤中采集适量样品，放入无菌容器中。
- 将样品用生理盐水稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3等不同浓度的稀释液。
2. 平板划线法分离：- 将稀释液分别涂布在平板分离培养基上。
- 使用无菌接种环，按照平板划线法进行划线操作。
- 将划线后的平板倒置，放入培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养。
3. 单菌落挑取：- 观察平板上的菌落，选择单个、形态一致、生长良好的菌落。
- 使用无菌接种环，将单个菌落挑取至新的平板分离培养基上。
- 重复上述操作，直至获得纯培养。
4. 纯培养鉴定：- 将纯培养的病菌进行显微观察，记录其形态、大小、颜色等特征。
- 对纯培养的病菌进行生化实验，鉴定其种类。
5. 结果记录与分析：- 将实验结果进行记录和分析，包括菌落特征、显微观察结果、生化实验结果等。
五、实验结果与分析1. 菌落特征：- 观察到纯培养的病菌菌落呈圆形、光滑、湿润、边缘整齐，菌落大小约为1-2mm。
2. 显微观察结果：- 显微镜下观察到纯培养的病菌为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，长度约为1-2μm。
3. 生化实验结果：- 纯培养的病菌在葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类培养基上生长良好，产酸产气。
常见病原菌分离方法
常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。
，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。
材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。
如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。
分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。
振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。
直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求1了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术;3掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法;二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能;为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株;植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种;最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离;病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法;为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法;三、材料、仪器与用具1．材料依当地情况进行选择,下列材料供参考1稻瘟病叶、病节、病穗颈pyricularia orycae;2玉米大斑病叶exserohilum turcicum;3玉米弯孢菌叶斑病叶curvularia lunata;4玉米小斑病叶bipolaris maydis;5番茄灰霉病果botrytis cinefca;6黄瓜菌核病果sclerotinia sclerotiorum;7黄瓜细菌性角斑病叶pseudomonas syringaepv．1achrymans;8水稻白叶枯病叶xanthomonas campestms pv.oryeue;9大豆细菌性斑点病叶pseudomonas syringaepv．glycinea;10白菜软腐病叶erudnia carotovora subsp．carotovora;2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等;3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等;0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml;先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释;升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心;四、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：1取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名;提示：为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话;2用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴可减少细菌污染,然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面;凝固后即成平板培养基;提示：加入25％乳酸1～2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落;除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法;加青霉素20μg／ml可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b5．0μg／ml可以抑制g—细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／ml可以抑制大部分细菌的生长;除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜’时加入;倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染;3取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料,选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处切取小块海边长3--4mm病组织数块;提示：选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会;腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离;4将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain也可使用其他表面消毒剂,如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些;然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂;提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70％的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短一般数秒至lmin;升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min;5用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块;提示：在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染; 6将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养;一般3—4d后观察待分离菌生长结果;7若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌;在无菌条件下,用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存;提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定;如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌;在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实,在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作;2．稀释分离法1取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名;2用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5～1．0ml;3用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中;4将熔化开冷却到45～50c的培养基,分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸,摇匀,凝固,要使培养基与稀释的菌液充分混匀;提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好,过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面,不利于分离;为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐,则大体为45~50c;5将培养皿翻转后置恒温箱2513中培养,数日后观察菌落生长情况;6挑菌;将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取,接种到斜面培养基上,置25℃左右培养;待菌长出后,检查菌是否单纯,若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养;二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用;在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后,才对该病组织作分离工作;稀释分离法是最经典的标准分离法,方法同上述真菌分离;除去上述稀释分离法以外,较为方便的是划线分离法：1预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30c恒温箱中2—4h,使表面无水滴凝结;也可凝成平板后直接使用;2将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎,并让组织碎块在水中浸泡20—60min,让细菌释放到灭菌水中; 3用灭菌的接种铒接种环蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破;划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线;灭菌后再划第三次线;提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大;4用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿,放在26～28c恒温箱中培养;1—3d后观察有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的;5仔细挑取病原菌的单菌落,并移植到斜面培养基上;同时,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化;三真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种,按前述稀释分离法中1--5步骤进行,待某培养皿中形成单个菌落后观察;记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等;同时要记载培养基种类成分及ph 和培养温度、光照条件;2．细菌培养性状观察1仿照上述真菌菌落形成步骤,观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,菌落生长速度快慢,是否有特殊气味形成等;同时要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;2用接种铒环蘸细菌菌种后,通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线,过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔,可仿照观察记载细菌菌落的记载内容,记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,是否有特殊气味生成,生长速度快慢等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;3用接种铒环蘸取细菌菌种后,通过无菌操作,将其接种在某种液体培养基中,数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成,培养液表面是否可生成菌膜等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织,表面消毒,无菌水洗移人平板：1h;稀释分离：配孢子悬液,倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min 保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线,1h;稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种;2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告;七、思考题1．如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果2．在分离病原真菌时,向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染3．如果要从土壤中分离某种病原菌,应当采取什么样的分离方法会更有效4．观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离;从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70％酒精中浸数秒钟后,移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养;2．维管束组织内病原菌的分离;从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上;3．根腐病病原菌的分离;根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定;材料小的可仿照斑点病的分离法,材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法;4．肉质组织中病原菌的分离;多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离;如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离;5．种子内病原菌分离;将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒升汞或漂白粉,用灭菌水洗涤后,移置培养基上;6．孢子分离法;能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之;7．土壤带菌分离法;为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的;分离方法是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离;。
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
微生物的分离纯化技术
微生物的分离纯化技术
微生物的分离纯化技术是指将混合微生物分离出单一种类，然后纯化该种类的技术。
以下是一些微生物的分离纯化技术：
1. 筛选法：通过选用某种特定培养基或特定条件（如pH、温度等），筛选出具有特定特性的微生物。
2. 稀释法：通过依次将样品进行稀释操作，使微生物的种类逐步减少，最终得到单种微生物。
3. 分离培养法：将混合样品分别涂布于不同的培养基表面，使微生物在不同培养基上生长和形态表现不同，最终分离出单一微生物。
4. 过滤法：通过将混合液体经过细孔过滤器，将细菌和病毒分离出来。
5. 凝胶电泳法：将提取出来的DNA通过凝胶电泳分析，识别出目标微生物并进行纯化。
6. 酶标记技术：利用特定抗体或酶标记系统与目标微生物进行特异性结合，分离出单一微生物。
总的来说，微生物的分离纯化技术需要根据不同的样品和目的选择不同的方法，
并结合多种技术手段才能最终得到纯种微生物。
植物病原菌的分离
植物病原菌的分离一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备1.分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2.分离用具：酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤（一）分离前的准备工作：1.工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。
病原实验报告
病原物的分离培养和纯化病原物的分离和纯化摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在pda培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。
关键词：分离培养、炭疽病、pda培养基、灭菌前言柯赫氏法则(koch’s rule)又称柯赫氏假设(kochs postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。
如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。
诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。
鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。
有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。
但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。
如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。
柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性【1】状与接种物相同”。
如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。
但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。
侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家都应能熟练地运用。
柯赫氏法则同样也适用来对非侵染性病害的诊断，只是以某种怀疑因子来代替病原物的作用，例如当判断是否缺乏某种元素而引起病害时，可以补施某种元素来缓解或消除其症状，即可确认是某元素的作用。
1. 材料、仪器与用具1.1实验材料柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、pda培养基（自制）1.2仪器用具超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 2. 内容与方法2.1培养基的配制“培养基按成分及对成分了解程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方法【2】不同。
水产动物病原菌的分离
实训三水产动物病原菌的分离一、实验目的:熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法。
二、实验器材:牛肉膏蛋白胨琼脂平板、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、酒精灯、记号笔、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅。
患细菌性疾病的水产动物。
三、实验步骤:分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病水产动物,病原菌的分离方法如下:1、接种分离体表分离:先将病灶部位表面用70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒,再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织,直接在普通琼脂平板上划线分离。
内部组织器官:用70%酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭,进行体表消毒,无菌打开病鱼的腹腔,以肝、肠、心脏等脏器为材料,先将拟分离病原的部位表面用70%酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧,以杀死表面的杂菌,随即在烧灼部位刺一小孔,用灭菌的接种环(待冷 2 ~ 5 秒)伸向烧灼部小洞中,用手指将接种环轻轻旋转两次,借以达到取足材料的目的。
鳃部:用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。
血液及体液:用无菌注射器吸取病鱼血液和体液,滴于平板涂布;或用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线,分离细菌。
划线分离的方法:左手持握普通琼脂平板,并靠近火焰,右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。
划线时接种环面与平板表面成30 ~40 度的角轻轻接触,在平板表面轻快地移动,接种环不应嵌入培养基内,且不要重复,否则形成菌苔。
划线完毕,盖上皿盖,接种环灭菌后放下,并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。
也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块,用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片,作多个触片,染色后在显微镜下直接镜检,能快速获得结果。
2、培养和观察接种后的平板经30 ℃左右培养24 ~72h 后,检查菌落生长情况,对菌落检查的主要内容包括:( 1 )大小:其大小以mm 表示,微小菌落:针尖大,直径小于0 . 5mm ,如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落;小菌落:直径在0 . 5 ~ 1 mm 之间,如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落;中等大小的菌落:直径在 1 ~ 3 mm 之间,如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落;大的菌落:直径大于3mm ,如炭疽芽孢杆菌菌落等。
水稻稻瘟病病原菌分离纯化及分子鉴定
收稿日期：2020-05-09基金项目：黑龙江省教育厅备案项目（1351MSYZD002）作者简介：赵世明（1995-），男，河北辛集人，在读硕士研究生，研究方向为微生物学，（电话）183****7607（电子信箱）****************；通信作者，律凤霞（1967-），教授，主要从事植物病理学及食用菌栽培的教学与科研工作，（电话）137****6717（电子信箱）**************。
稻瘟病是水稻栽培中的重要病害之一，中国南北稻区均有稻瘟病发生［1］，病害流行地区轻则减产10%~50%，严重罹病的稻田甚至绝收［2］。
稻瘟病在水稻的各个时期及各个部位均有可能发病，尤其是棚内育苗期、插秧后分蘖、抽穗初期更易感病［3-5］。
植物病害的防治应做到以防为主治疗为辅，最大限度规避化学防治，减少农药残留，有利于消费者身体健康，有利于有机农业的良性循环和健康发展［6，7］。
而分离纯化获得植物病原菌纯培养物，是了解该病原菌生物学特性和生态学习性的前提，是植物病害防控及抗病育种的基础［8-11］。
本研究从牡丹江市不同水稻栽培地采集疑似感染稻瘟病的水稻叶片，用PDA 培养基进行病原菌纯化初培养，通过观察菌落黑色素产生及分生孢子的形态进行初筛鉴别；采用CTAB 法提取菌丝DNA ，以稻瘟病菌特异引物进行PCR 扩增，对扩增产物进行测序及NCBI 网站比对验证，获得纯化后的病原稻瘟菌。
水稻稻瘟病病原菌分离纯化及分子鉴定赵世明，王美玲，律凤霞（牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江157012）摘要：从牡丹江市不同水稻栽培地采集疑似感染稻瘟病的水稻叶片，用PDA 培养基进行病原菌分离纯化培养，通过观察菌落黑色素及分生孢子的形态进行初筛鉴别；采用试剂盒提取菌丝DNA ，利用稻瘟病菌特异引物进行PCR 扩增，对扩增产物进行测序及Nucleotide Blast 比对。
结果表明，6个栽培区采集病样经初筛确定5株有黑色素分泌且观察到其分生孢子，测序证实其中2个样品PCR 产物序列相同，且与NCBI 网站公布的半知菌亚门的灰梨孢（Pyricularia grisea ）高度同源，确定获得稻瘟病菌纯菌株。
设计实验微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术一．实验目的1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。
2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。
3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。
二.实验原理菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1.涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
2.平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
大肠菌群的培养鉴定大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。
还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。
其他病原菌的菌落呈粉红色。
再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。
即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。
菌种保藏菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。
保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。
对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的三.实验器材1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基和马铃薯固体斜面培养基。
怎样进行病原菌的分离
如何进行病原菌的分离、纯培养材料用具菌种：米曲酶 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球 白地霉 蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。
仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。
微生物的分离与纯化：一、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。
(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。
二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。
为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。
植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。
最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。
病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。
（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。
(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。
(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。
(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。
（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。
(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。
植物病理学教学实践报告(3篇)
第1篇一、引言植物病理学是一门研究植物病害的发生、发展和防治的学科。
随着我国农业现代化进程的加快，植物病害对农业生产的影响日益严重。
为了提高学生的植物病理学理论知识和实践能力，我校于近期组织了一次植物病理学教学实践活动。
本文将总结本次实践活动的经验和体会，为今后的教学提供参考。
二、实践背景1. 植物病害问题日益严重近年来，我国农业生产中植物病害问题日益严重，严重影响着农作物的产量和品质。
据统计，我国每年因植物病害造成的经济损失高达数百亿元。
2. 植物病理学教学现状目前，我国高校植物病理学教学主要以课堂讲授为主，实践环节相对较少。
这使得学生在掌握理论知识的同时，缺乏实际操作能力和病害诊断能力。
3. 实践教学的重要性实践教学是提高学生综合素质、培养创新人才的重要途径。
通过植物病理学教学实践活动，可以让学生深入了解病害发生规律，提高病害诊断和防治能力。
三、实践内容1. 病害标本采集与鉴定在实践活动中，我们组织学生到田间采集病害标本。
学生通过观察病害症状、采集病样，初步了解病害种类和发生规律。
随后，指导教师带领学生进行病害标本的鉴定，使学生掌握病害鉴定方法。
2. 病原菌分离与培养在实验室，学生学习了病原菌分离和纯化的方法。
通过操作，学生掌握了病原菌的分离纯化技术，为后续的病害研究奠定了基础。
3. 病害诊断与防治在实践活动中，学生学习了病害诊断的基本方法，包括症状观察、病原菌鉴定等。
同时，指导教师结合实际案例，向学生介绍了病害的防治措施，如生物防治、化学防治等。
4. 病害调查与监测学生分组进行田间病害调查，了解病害发生规律、危害程度等。
通过调查，学生掌握了病害监测的基本方法，为农业生产提供科学依据。
四、实践体会1. 提高了学生的实践能力通过本次实践活动，学生掌握了植物病理学的基本操作技能，提高了病害诊断和防治能力。
2. 培养了学生的团队合作精神在实践活动中，学生分组进行病害调查和监测，培养了他们的团队合作精神。
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普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。
(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。
(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。
(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。
(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。
(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。
2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。
0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。
先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。
升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。
四、实验操作(一)病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：(1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。
提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
(2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。
凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。
除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。
加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。
除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加入。
倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。
(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。
腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
(4)将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。
然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。
升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3，5min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4--6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养。
一般3—4d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。
如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的蕾落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上，完成分离工作。
2．稀释分离法(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。
(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化开冷却到45～50c的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。
为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50c。
(5)将培养皿翻转后置恒温箱(2513)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌。
将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25℃左右培养。
待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。
(二)病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。
在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。
稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30c恒温箱中2—4h，使表面无水滴凝结。
也可凝成平板后直接使用。
(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。
划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。
灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28c 恒温箱中培养。
1—3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。
同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。
最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种，按前述稀释分离法中(1)--(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。
记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。
同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。
同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。
也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。
也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织，表面消毒，无菌水洗移人平板：1h。
稀释分离：配孢子悬液，倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线，1h。
稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种。
2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告。