流式细胞凋亡分析
流式细胞凋亡原理
流式细胞凋亡原理
细胞凋亡是一种由细胞内部调控的程序性死亡过程，它在生物体的正常发育过程中起到重要的作用。
在这个过程中，细胞通过一系列的生物化学反应，自我分解并最终死亡。
流式细胞凋亡分析是一种常用的方法，用于检测细胞凋亡的程度和特征。
流式细胞凋亡分析的基本原理是利用流式细胞仪对细胞进行分析。
通常，细胞凋亡会引起细胞中DNA的断裂和核蛋白的降解。
在实验中，细胞被染色剂如荧光素一亚胺（propidium iodide，PI）等染色，这种染色剂只能进入破损的细胞核，并与DNA结合。
通过流式细胞仪的激光器激发这些染色剂，然后根据细胞核中DNA的含量，可以将细胞分为不同的群体。
正常细胞的DNA含量通常是稳定的，而凋亡细胞的DNA会出现不同程度的断裂。
因此，通过分析细胞在不同区域的分布情况，可以推断细胞中凋亡的程度。
常用的方法是使用峰值计数，即测量细胞在不同区域的峰值数量，并将其与正常细胞进行比较。
此外，还可以使用其他标记物如ANNEXIN V等来检测细胞的凋亡程度。
流式细胞凋亡分析具有高通量、高准确性和高灵敏度的特点，因此在基础研究和临床诊断中得到了广泛应用。
它可以用于检测细胞凋亡的发生机制、筛选药物的活性以及评估治疗效果。
同时，流式细胞凋亡分析还可以与其他技术如细胞培养和基因表达分析等相结合，为细胞凋亡的研究提供更全面的信息。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡A n n e x i n V检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的D N A断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。
细胞凋亡流式细胞术检测
该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
流式测细胞凋亡原理
流式测细胞凋亡原理
细胞凋亡是一种形态学特征独特的程序性细胞死亡方式，它在多种生理和病理状态下发挥重要作用。
流式细胞术可以用来分析和测量细胞凋亡，其中包括细胞表面标记物的检测和细胞染色。
流式细胞术是一种流式细胞仪结合荧光标记物的技术。
在细胞凋亡的研究中，最常用的荧光染料是亚碧菜素（annexin V）和PI（propidium iodide）。
亚碧菜素可以结合凋亡细胞表面的磷脂（phosphatidylserine），而PI则可以进入破损的细胞膜并结合DNA。
流式细胞术中，细胞样本首先经过适当的处理，如细胞固定和染色，以保持细胞形态并增强荧光信号。
然后，样本通过流式细胞仪中的流动通道，单个细胞经过激光束的照射而产生荧光信号。
流式细胞仪会同时检测和记录细胞的形态学特征和荧光信号。
在细胞凋亡的测量中，亚碧菜素和PI的荧光信号用于区分不同类型的细胞。
在正常细胞中，磷脂位于细胞膜的内侧，不会结合亚碧菜素。
而在凋亡细胞中，磷脂外露到细胞膜的外侧，可以与亚碧菜素结合。
通过检测亚碧菜素的荧光信号，可以确定凋亡细胞的比例。
同时，PI的荧光信号用于鉴定破损的细胞，因为PI只能进入破损的细胞并结合DNA。
通过流式细胞术，可以获得细胞凋亡的定量信息，例如凋亡细
胞的比例和凋亡细胞的亚型。
这对于研究细胞凋亡的机制以及相关疾病的发生和发展具有重要意义。
流式细胞仪检测细胞凋亡的几种方法的比较
以往分析细胞凋亡 只是关心细胞是死是活 ， 而现在更加 关注细胞到底是怎么死的 ， 因为哪条通路受到了影响， 究竟哪
个 阶 段发 生 了 凋亡 ， 该 如何 去 阻 止 它 。 亡是 一 个相 当复 杂 应 凋
更多不 同的方法来验证细胞 的死亡方式 。 流式细胞仪（ ｌ ｙ ｍ ｔＦ Ｍ） 一种在功能水平上对 Ｆｏ ｃｔ ｅ，Ｃ 是 ｗ ｏ 单细胞 或其它生 物粒子 进行定 量分析 和分选 的检测 手段 ，
ａ ｏ ｔ ｉ ｃ ｌ Ｂ ｔ ｍｂ ｅ ｉ ｏｐ ｏ ｇ ｅ ｎ ｌ ｉ ｗ ｌｂ ｏｅ ｂｅ ｔ ｅ Ｃ ｎ ｌ ｓｏ ： ｈｏ ｇ ｍｐ ｒ ｇｅ ｐｒ ａ ｍ ｔ ｄ ｐ ｐｏ ｓ ｅ ． ｕ ｃ ｉ ｄｗｔ ｍ ｒｈ ｌ ｙｔ ａ ｓ ｉ ｅｍ ｒ ｏ ｊｃ ｖ ． ｏ ｃ ｉ ｎ Ｔ ｒｕ ｈｃ ａｉ ｍ ｉｃ ｅ ｏ ， ｓ １ ｉｏ ｎ ｆ ｈ ｏ ｈ ａ ｙｓ ｌ ｉ ｕ ｏ ｎ ｉｌ ｈ
ｗｅｆｎ ｒ ｒ ｃｓ ｔｏ ｆｕ ｉｇｔ ｏ Ｃｙｏ ｔｙｔ ｘ ｍ ｉｅｔ ｐ ｐｔｓｓｉ ｈｅｆ ｕ ｅ ｄ ｍｏ ｅｐ ｅ ｉｅｍｅｈ ｄｓｏ ｓｎ Ｆｌｗ ｔｍｅｒ ｏｅ ａ ｎ ａ ｏ ｏ ｉ ｎｔ ｕｔｒ ． ｉ ｈｅ ｈｅ
【 ｅ ｏｄ 】 ｌ ｙ ｍ ｔ ；ｐ ｐｏｉ； Ｎ ｎｅｔＰ ｏｐ ａｉ ｌｅｉ ； ｉ ｃｏ ｄｉ ｅ ｂａ ｅ ｏ ｎｉ ； ａ ｉｍ ｏ Ｋ ｙ ｒｓ Ｆｏ Ｃ ｔ ｅ ｙ Ａ ｏｔ ｓＤ Ａ ｃ ｔ ；ｈｓｈｔ ｙ ｓｒ ｅ Ｍｔ ｈｎ ｒ ｌ ｍ ｒｎ ｔ ｔ ｌ Ｃ ｃｕ ｉ ｗ ｗ ｏ ｒ ｓ ｏ ｎ ｄ ｎ ｃ ａｍ ｐｅ ａ ｌ ｎ
【 关键词 】 流式细胞仪 ； 细胞凋亡 ； Ｎ Ｄ Ａ含量 ； 磷脂酰丝氨酸 ； 电位 ； 膜 钙离子 【 中国图书分类法分类号 】３９ Ｒ ２． ２ 【 文献标识码 】 Ａ 【 收稿 日 】 ０—５ ２ 期 ２ ９０—６ ０
流式细胞术在细胞凋亡检测中应用
检测究竟是如何进行的呢？一、细胞凋亡检测的意义和方法正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期上图为流式测定细胞凋亡图，通过PI染色来测定细胞含量。
正常的细胞的周期为第一张图中所示的G1、G0期，S期、G2/M期，那么在G1、0期前面没有亚二倍体峰，也就是M1这个位置它的含量会很低。
这是一个正常细胞的周期时相，当这个细胞发生凋亡之后，在G1G0期的前面出现了一个亚二倍体峰，我们也把它叫做凋亡峰，M1这个位置细胞数百分率明显增多，相对其他的时相，G1G0、S期和G2/M期的含量就会相对减少。
（3）获取参数通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数：凋亡细胞的百分率，和细胞周期当中其它时相的百分率。
（4）方法学评价DNA含量分析方法比较简便，而且经济，在临床上用的比较多，而且标本制备也比较容易，但是它有它的缺点：只有当凋亡细胞达到一定浓度的时候才能够检测出亡峰来。
所以在早期凋亡的时候采用DNA含量分析可能是不合适的，因为可能检测不出凋亡峰，含量太少。
所以比较适合的是中晚期凋亡的检测。
另外DNA含量分析也无法获取一些信息，也就是这个凋亡到底是S期还是G2/M期，有的时候无法反应这个情况。
2.Caspase-3活性的检测（1）原理检测原理主要是由于半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族，也叫做Caspases-3的家族有一种酶：是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。
该酶的活性被激活之后，就在整个凋亡过程当中不断地升高，直到凋亡的晚期酶的活性才能够迅速下降。
因此，对Caspase-3酶的连续检测可以动态地观察凋亡的整个过程。
（2）检测试剂通常检测此酶的活性的试剂包括一个荧光底物，其中它的荧光基团被激活的Caspase-3切断后可以释放荧光物质，在380nm的紫外波长下发出450nm波长的荧光，这样就可以用流式细胞仪来检测。
我们通常通过对荧光强度的检测来测定出Caspase-3的活性并进行定量分析。
但是由于它是紫外激发的检测方式，因此对于没有紫外光的流式细胞仪是无法来获取Caspase-3的活性检测信息。
PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的影响因素
基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
谢谢观看
解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生 物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。 对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这 些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护 以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的 控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并 使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性 改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映 细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、 准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋 亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实 现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细 胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐， 且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
流式检测细胞凋亡
流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
流式细胞术检测细胞凋亡问题
1、Q： Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？A：可以。
因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。
请问这是什么原因导致的？A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。
双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。
TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA 片段化。
而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。
但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。
双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。
流式检测凋亡的讨论
流式检测凋亡的讨论关于凋亡的流式检测wanhood一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
流式凋亡检测原理
流式凋亡检测原理
流式凋亡检测原理是一种基于流式细胞术的细胞凋亡检测方法。
细胞凋亡是一种自我程序性死亡方式，它在维持机体内部环境稳态和细胞生长发育中起着重要作用。
因此，对于细胞凋亡的研究具有重要的生物学意义。
流式凋亡检测原理基于细胞死亡过程中细胞膜磷脂外翻和细胞
核DNA片段化两个生物化学特性。
在细胞死亡的早期阶段，磷脂外翻导致细胞膜上的磷脂分子从细胞内侧翻转到胞外侧，使得细胞表面暴露出磷脂分子。
同时，DNA片段化会导致DNA碎片在细胞内释放。
流式凋亡检测原理利用荧光标记的磷脂分子和DNA染料，通过流式细胞术检测细胞膜上磷脂外翻和DNA片段化的信号，可以快速、准确地检测细胞凋亡。
该方法具有高灵敏度、高精度、高通量等优点，尤其适用于研究大量样本的凋亡检测。
总之，流式凋亡检测原理是一种重要的细胞凋亡检测技术，其原理和方法的研究可以为细胞凋亡的研究提供有力的技术支持。
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流式细胞凋亡分析
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
目前已发现15个caspase家族成员分别 命名为caspase-1～15并根据其功能特点 分成两类即启动caspasecaspase-2、8、 9、10和效应caspasecaspase3、6、7
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
细胞凋亡的特征
生化特征： 2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱 导因子使线粒体通透性升高膜上巨型通道开 放使线粒体蛋白进入细胞液中线粒体膜两侧 质子不对称性消失线粒体膜电位迅速下降电 子传递与呼吸链解偶联
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
其中半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作 用它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序 列可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰 酶残基由于这些蛋白酶具有相同的结构和功 能特性而被称为caspase
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用Caspase通常是以酶原形式 存在通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有 活性的酶活化的caspase进一步激活其他的 caspase前体形成了级联放大切割过程裂解 重要的大分子物质导致凋亡
概念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：
清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；
细胞凋亡的特征
形态学特征：
光镜下凋亡细胞最突出的形态学特征是 细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而 细胞膜保持完整其中胞核变化尤为突出染色 质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA 发生裂解所致细胞凋Leabharlann 与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：
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细胞凋亡的特征
形态学特征： 形态学特征： DNA降解后，形成长度主要为180DNA降解后，形成长度主要为180降解后 180 200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有 200bp的DNA片断， 片断 膜包被的小体，称为凋亡小体（ 膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞噬 最后被巨噬细胞吞噬， bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引 起周围组织的炎症反应。 起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡 细胞特征性的标志。 细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到 凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。 凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。
概 念
细胞凋亡是维持人体正常生理过程和 功能活动所必需的， 功能活动所必需的，是多细胞生物生命活 动过程中不可缺少的组成内容， 动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以 存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。 存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。
概 念
细胞凋亡与细胞坏死（necrosis） 细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是 细胞死亡的两种模式， 细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区 别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大 剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过 并可导致周围组织的炎症反应。 程，并可导致周围组织的炎症反应。
流式细胞凋亡分析
概 念
细胞凋亡（apoptosis） 细胞凋亡（apoptosis）是指有核细 胞在一定条件下通过启动其内部自身机制， 胞在一定条件下通过启动其内部自身机制， 主要是通过内源性DNA DNA内切酶的激活而发 主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发 生的细胞死亡过程。 生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控 制的一种主动性细胞自杀过程， 制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体 中一种普遍存在的现象。 中一种普遍存在的现象。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： caspase蛋白酶 蛋白酶： 1 caspase蛋白酶： caspase- 是最重要的指示蛋白酶， caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体 亚单位组成的异二聚体。 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化 的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他 caspasecaspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18 18， caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18， CK18)和细胞核靶位点 Caspase和细胞核靶位点。 CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割 CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期 是凋亡过程中caspase CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期 指示因子。 指示因子。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： caspase蛋白酶 蛋白酶： 1 caspase蛋白酶： 启动caspase作用于凋亡信号触发后上 启动caspase作用于凋亡信号触发后上 caspase 游的不可逆位点。效应caspase caspase由启动胱冬 游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬 肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解 肽酶激活，作用于下游的执行位点， 细胞成凋亡小体。 细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这 两部分影响线粒体， 两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行 凋亡的信号。bcl凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位 点的进程。 点的进程。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： caspase蛋白酶 蛋白酶： 1 caspase蛋白酶： caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式 起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式 存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化 存在， 为有活性的酶，活化的caspase caspase进一步激活 为有活性的酶，活化的caspase进一步激活 其他的caspase前体， caspase前体 其他的caspase前体，形成了级联放大切割 过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。 过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： caspase蛋白酶 蛋白酶： 1 caspase蛋白酶： 细胞凋亡的发生和发展过程也可能是 水解酶级联切割的过程， 水解酶级联切割的过程，它将大分子结构 的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子 的物质如DNA、 DNA 碎片，致使细胞发生凋亡。 碎片，致使细胞发生凋亡。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： caspase蛋白酶 蛋白酶： 1 caspase蛋白酶： 其中， 其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重 要作用。 要作用。它具有一段携带活化位点的保守 氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬 氨基酸序列，可以特异性识别、 氨酸转氨甲酰酶残基。 氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具 有相同的结构和功能特性而被称为caspase caspase。 有相同的结构和功能特性而被称为caspase。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： 胞质Ca pH的变化 的变化： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 细胞内Ca 细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命 活动至关重要。胞内Ca 库的释放， 活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质 Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流促 与细胞凋亡关系密切。胞外Ca 使胞质Ca 持续升高， 使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋 亡发生。 亡发生。
细胞凋亡的特征
形态学特征： 形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提 DNA DNA凝胶电泳分析 可呈现出梯状图谱， 凝胶电泳分析， 取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱， 可见清晰的DNA 梯子〞(ladder)。 DNA〝 可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。
细胞凋亡的基因调控
细胞凋亡受基因的调控，其机制非常 细胞凋亡受基因的调控， 复杂。凋亡基因可分为两类： 复杂。凋亡基因可分为两类： 1诱导基因：野生型p53基因、c-myc、细胞 诱导基因：野生型p53基因、 myc、 p53基因 表面抗原基因Apo 1(Fas)等 Apo表面抗原基因Apo-1(Fas)等 2抑制基因：bcl-2、突变型p53基因和ras 抑制基因：bcl突变型p53基因和ras p53基因和 基因等
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： 胞质Ca pH的变化 的变化： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 此外， 此外，Ca2+的释放打破了细胞内结构的 稳定， 稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分 开始和细胞结构正常时不能接触到的基质 接触，从而触发细胞凋亡。 接触，从而触发细胞凋亡。
细胞凋亡的特征
细胞凋亡的特征
形态学特征： 形态学特征： 电镜下，细胞核内可见高电子密度区， 电镜下，细胞核内可见高电子密度区， 这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后， 这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后， DNA在核小体连接处断裂成核小体后 在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。 在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。 染色质聚集区以外的低电子密度区为透明 是由于核孔变大导致其通透性增加， 区，是由于核孔变大导致其通透性增加， 细胞质中水分不断渗入而造成。 细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增 殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细 呈空泡化。内质网腔扩大， 胞形成自噬体提供包裹膜。 胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得 致密、紊乱。 致密、紊乱。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： 线粒体的变化： 3 线粒体的变化： 线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡 的早期。 的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧 质子和其他离子分布不对称造成的。线粒 质子和其他离子分布不对称造成的。 体参与了凋亡的调控和实施。 体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切 相关的bcl 家族分布在细胞内膜系统， bcl相关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其 中线粒体外膜上分布最多，bcl中线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制 线粒体通透性变化的能力， 线粒体通透性变化的能力，并通过此途径 抑制细胞凋亡。 抑制细胞凋亡。
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： 核酸内切酶的激活： 2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡的特征
生化特征： 生化特征： 线粒体的变化： 3 线粒体的变化： 线粒体发生的重要改变之一就是凋亡 诱导因子使线粒体通透性升高， 诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型 通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中， 通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中， 线粒体膜两侧质子不对称性消失， 线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体 膜电位迅速下降， 膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶 联。
概 念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 清除无功能的细胞； 清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞； 清除多余的细胞；
细胞凋亡的特征
形态学特征： 形态学特征： 光镜下， 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特 征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆 征是细胞核固缩、染色质浓集、 皱缩而细胞膜保持完整， 皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤 为突出。 为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细 胞核双链DNA发生裂解所致。 DNA发生裂解所致 胞核双链DNA发生裂解所致。