蛋白质表征技术PPT课件

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3.3 氨基酸的理化性质
3.3.1 两性解离及其等电点
❖ 氨基酸是两性电解质： 氨基酸既含羧基,又含氨基,同时能起酸和碱的作用，是
两性电解质，在水溶液中主要以兼性离子（偶极离子）的 形式存在。
❖ 氨基酸的等电点： 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的趋势和
程度相等而成为兼性离子，呈电中性时溶液的pH称为该氨 基酸的等电点（isoelectric point，pI）。
3.3.3 茚三酮反应
氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色化合物，在 570nm处有最大吸收峰，可以作为定量测定氨基酸的方法。
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4肽
4.1 肽键
一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩 合形成的共价键（-CO—NH-）称为肽键，又称酰胺键。 蛋白质分子中的氨基酸通过肽键连接。
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4.2 肽
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代表不同的氨基酸
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各种氨基酸在结构上有下列共同特点： 组成蛋白质的氨基酸皆为α-氨基酸。
❖ 不同的α-氨基酸，其R侧链不同（氨基酸分类的依据）。它对蛋 白质的空间结构和理化性质有重要的影响。
❖ 除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所连接的 四个原子或基团互不相同，该碳原子都是不对称碳原子。
氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽。
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4.3 氨基酸残基（residue）
氨基酸在形成肽链后，因有部分基团参加肽键的形成，已经不是 完整的氨基酸，故将蛋白质肽链中的每个氨基酸部分称为氨基酸残基。
每一个氨基酸残基上都有一个R侧链，不同R侧链有不同的性质和 功能。
多肽链有两端：
具有游离α-氨基的称为氨基末端（N-末端，amino terminal），通 常写在肽链的左端。
方法： 目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的 Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋 白序列；其二为质谱技术。各自都有其使用的长处和制约之处，目前，市面 上 采 用 的 ， 依 然 是 基 于 经 典 的 Edman 降 解 法 原 理 ， 利 用 美 国 ABI 公 司 Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。
具有游离α-羧基的称为羧基末端（C-末端，carboxyl terminal），常 写在肽链的右端。
多肽链的方向从N-端到C-端，肽链也是从N-端到C-端按氨基酸残 基的顺序来命名的。
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N端测序
几乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整 体的生物学功能有着巨大的影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期，同 时关联着蛋白亚细胞器定位等，这些与蛋白的功能和稳定性息息相关，对蛋 白进行N-端测序分析，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生 物学功能。
蛋白质表征技术
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1 蛋白质的基本概念
蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子， 是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没 有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。
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2 蛋白质的元Βιβλιοθήκη Baidu组成
蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，在元素组成上 亦有差别。
根据蛋白质的元素分析表明，其元素组成依次为：碳 (50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19%）、氢（6-7%） 硫（0-4%）。有的还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、 钼、碘等元素。一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含 氮量比较接近而恒定，一般为15—17％，平均为16％。这 是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是各种定氮法测定 蛋白质含量的计算基础。即用定氮法测得的含氮量乘以 6．25，即可算出样品中蛋白质的含量。但有的蛋白质中 氮的含量有一定差别，应根据其氮的真实含量进行计算。
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3 蛋白质结构的基本单位—氨基酸
3.1 氨基酸的结构
自然界的氨基酸超过300种，但是组成人体蛋白质的氨 基酸有20种，可以看作是羧酸分子中α-碳原子上的氢原子 被氨基取代而成的化合物，均属于α-氨基酸，即其氨基和 羧基都连接在α-碳原子上。
氨基酸碳链表示：
其结构可用下列通式表示：
注：R代表不同的侧链基团，R不同
其R基团含碱性基团，在pH7时，这些基团可质子化而使分子带正 电荷。 3）非极性疏水性氨基酸
其R基团无极性、不解离，且为疏水性的。 4）不解离的极性氨基酸（极性非电离氨基酸）——羟基氨基酸+巯基氨
基酸+甘氨酸 其R基团虽有极性但不能解离。
5）蛋白质中少见的氨基酸——无遗传密码，来自翻译后加工修饰。
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❖ 20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基，所以它是亚氨基酸。半胱 氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在。
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3.2 氨基酸的分类
根据侧链R基团的结构和性质进行分类：
1）酸性氨基酸——谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp 其R基团含羧基，在pH7时，羧基可解离而使分子带负电荷。游离
或在蛋白质中都带负电荷，以酸根形式存在。在蛋白质中与正电基团 形成盐键。 2）碱性氨基酸——赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His
原理：Edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的
N-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨
（ATZ）转化为苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个
循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进
行下一个Edman降解，最后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测
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3.3.2 紫外吸收性质
20 种 氨 基 酸 在 可 见 光 区 无 吸 收 。 在 远 紫 外 区 ： ＜ 220nm都有光吸收。在近紫外光区（220-300nm）只有苯 丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收；色氨酸、酪氨酸的最大 吸收峰都在280nm附近。
由于大多数蛋白质中含有色氨酸和酪氨酸残基，所以 可以测定蛋白质溶液的280nm的光吸收值对蛋白质进行定 量分析。
定。
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C端测序
众所周知，C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位，对 蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。此外，由于蛋白翻译后在细胞 内需要进一步剪切和修饰，通常不能简单的使用基因序列对C-端或N 端做简单的预测，对于蛋白生物制品来说，使用C-端测序必不可少， 随着蛋白质组学研究的不断深入，蛋白质C端测序对其功能研究将发 挥越来越重要的作用。一些新的蛋白质C端测序方法已建立，提高了 灵敏度和重复性，能够在蛋白质组水平应用。