不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨免疫组化结果的影响

不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨免疫组化结果的影
响
沈溪明;何欣欣;吴东霞;陈耿标;王林
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2014(030)006
【总页数】3页(P696-698)
【关键词】EDTA;脱钙液;下颌骨;免疫组织化学
【作者】沈溪明;何欣欣;吴东霞;陈耿标;王林
【作者单位】中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院
病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第
二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120
【正文语种】中文
【中图分类】R446.6
传统骨组织脱钙常采用酸性液体，但易导致组织结构难以保持完整，影响病理学进一步诊断。

骨组织用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为脱钙液进行脱钙，能使骨组织
中的蛋白抗原保持完好，组织细胞结构保持完整清晰。

已有大量文献报道肯定了EDTA脱钙液的作用，但对EDTA脱钙液的适宜浓度和pH值报道不一［1，2］。

本文旨在探讨不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨组织HE形态和免疫组化结果的影响。

1.1 材料随机选取25例中山大学附属第二医院病理科下颌骨标本，常规经10%中
性福尔马林固定24 h。

随机分为5组:10%EDTA(pH 9.01)为A组，
15%EDTA(pH 11.0)为B组，10%EDTA(pH 11.0)为C组，15%EDTA(pH 9.01)为D组，14%硝酸脱钙液为硝酸组，组织标本组切割为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm 大小。

1.2 脱钙液的配制使用100 ml双蒸水将10 g EDTA配成浓度为10%EDTA，双蒸水100 ml+15 g EDTA配成浓度15%EDTA，分别加入 1 mmol/L NaOH 和 1 mmol/L HCl，将pH调至9.01和11.0。

14%硝酸脱钙液:86 ml双蒸水+14 ml 浓硝酸。

1.3 脱钙方法将大小均匀的骨组织放入平底小烧瓶中，分别装入上述各浓度和pH 值的脱钙液，以微波低火档每次辐射5～20 min，室温10 min冷却，保证每次辐射脱钙液的温度不高于55℃，每5个循环更换一次脱钙液，以大头大针可刺入骨组织为完成脱钙。

1.4 免疫组化组织脱钙后，充分冲洗，常规处理、切片。

微波抗原修复，使用EnVision两步法进行免疫组化染色，检查骨组织中vimentin、S-100、MBP和CD68的表达。

1.5 结果判断 vimentin、S-100、MBP和CD68表达均定为于细胞质。

镜下选取5个视野，将阳性信号通过摄像机转换为数字图像，在计算机上计算阳性细胞的平均光密度值，其代表相应抗原的表达强度。

1.6 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，多组计量资料比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验。

2.1 各组脱钙时间和HE染色效果的比较光镜下A、B、C、D四组骨小梁组织均几乎无损害，HE染色细胞核和细胞质颜色清晰，对比明显，染色质清楚，而硝酸组骨组织破坏严重，结构不清(图1)，脱钙时间方面以硝酸组最短，但结构破坏最严重，而在同一浓度中，EDTA(pH 9.01)的脱钙时间较短(表1)。

2.2 各组免疫组化染色效果的比较应用免疫组化检测vimentin、S-100、MBP和CD68的表达时，以A组脱钙液最能保存骨组织中抗原物质，结构清晰显示，光
密度值为27.14±5.25，略高于 B、C和D组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

随着pH值增大，骨组织有不同程度的破坏，但均显著高于硝酸组，差异有统计学意义(P＜0.05，表2，图2)。

脱钙是指用物理或化学方法将骨组织标本中有机组织和钙盐分离，通过去除钙盐和无机盐从而获得完整的胶原纤维组织，只有去除无机盐物质，才能使组织软化行切片染色观察［3］。

不同脱钙方法对组织的破坏程度和免疫组化结果均有影响，好的脱钙液应不破坏骨组织结构和骨细胞形态，保持较好的抗原活性，以得到较好的免疫组化染色结果［4］。

脱钙液中单纯酸类的代表是14%硝酸，研究认为，酸类浓度越高、脱钙时间越短［5］。

而8%硝酸脱钙后免疫组化效果最差，背景深［6］，硝酸具有脱钙能力强、时间短等优点，但容易出现过度脱钙的现象，细胞明显肿胀、细胞结构不完整，其可能原理是硝酸在脱钙过程中容易产生二氧化碳，导致结缔组织分离，细胞核染色能力减弱，返蓝困难而至细胞核呈淡红色，对比度明显降低［7，8］。

另外硝酸
对骨组织的抗原性破坏较大，导致细胞的抗原免疫活性明显降低，免疫组化结果不佳，影响临床观察和诊断［9］。

螯合剂是另一种常用的脱钙液，通过与金属离子结合达到脱钙目的。

常用的螯合剂是EDTA，其具有对组织破坏少、脱钙时间短、pH值适合和不产生气泡等优点［10］。

有研究比较4% ～16%不同浓度EDTA
的脱钙效果，结果表明10%和13%EDTA的脱钙效果最佳，HE染色对比度佳，
细胞着色明显，背景淡。

早在1993年国外有研究对比EDTA、硝酸和乙酸的脱钙效果，结果表明EDTA脱钙的骨组织最能反应组织mRNA的实际含量［11］。

也有学者采用DNA组织化学染色法比较不同脱钙液的脱钙效果，结果显示5%乙酸
和10%EDTA均可用于DNA组织化学和末端缺口标记［12］。

目前国内对EDTA
脱钙液的适宜浓度和pH值的文献报道不一，本实验选取25例下颌骨组织，比较相同条件下不同pH值和浓度EDTA的脱钙效果和对免疫组化结果的影响。

本实验发现，10%EDTA(pH 9.01)脱钙液所需的脱钙时间最短，制片质量最好，组织无裂开、破碎现象，HE染色显示清楚，骨组织结构保持完整，免疫组化染色效果最佳，阳性信号定位准确。

其可能原理是EDTA水溶液主要存在7种亚体，而不同pH值的EDTA溶液存在不同亚体，只有Y4-才能与金属离子直接生成稳定的配合物［13］，因此本实验中较高pH值脱钙液的脱钙时间较快。

此外，EDTA 与钙离子的反应主要为配位反应，而配位反应易受到其他因素的影响，如pH值、其他配位制、共存离子等，其中酸性反应的影响最大［14］。

有报道表明，pH 9.0时酸性反应系数为1.29(系数接近1.0时EDTA配位能力最强)，蛋白质的基本组成是20种氨基酸，每种氨基酸都有不同等电位，其中17种氨基酸的等电位都小于7.0，而骨组织中的组成成分大多是结合蛋白［15］。

根据骨蛋白的特性，控制pH值在一定范围内不会引起蛋白质变性，提示在进行免疫组化时可以选择不同pH值修复液进行修复抗原以达到最佳染色效果。

［1］杨传红，赖晃文，唐赓云，等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择［J］.临床与实验病理学杂志，1996，12(4):357－8.
［2］胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11(3):263.
［3］罗灿峤，莫木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用［J］.中国实用医药，2011，6(19):27－8.
［4］连丽琴，夏凌志，钟惠霞.三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析［J］.武警医学，2008，19(10):937－8.
［5］Yamamoto-Fukud T，Shibata Y，Hishikawa Y，et al.Effects of var-ious decalcification protocolson detection of DNAstrand breaksbyterminal
dUTP nick end labeling［J］.Histochem J，2000，32(11):697－702，
［6］陈世梁，卢志承，董玉英.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用［J］.
临床与实验病理学杂志，2009，25(5):557－8.
［7］谢玲，邹丽宜，张志平，等.改良脱钙液制作脱钙骨石蜡切片与传统方法的
比较［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2125 －8.
［8］Weisberg E C，Hilburn M，Johnson B，et al.Intraoperative Microwave processing of bone margins during resection of head and neck cancer［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2001，127(7):790－3. ［9］张大贵，林小芳，张普.三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响［J］.中国现代医生，2012，50(24):101－5.
［10］Cunningham C D，Schulte B A，Bianchi L M，et al.Microwave decacification of human temporal bones［J］.Laryngoscope，2001，
111(2):278－82.
［11］Walsh L，Freemont A J，Hoylland J A.The effect of tissue decalcifcation on mRNAretentionwithin bone for in-situ hybridization studies［J］.Int J Exp Pathol，1993，74(3):237 － 41.
［12］Shibata Y，Fujita S，Takahashi H，et al.Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues［J］.Histochem Cell Biol，2000，
113(3):153 －9.
［13］万蕾，章锦才.不同脱钙方式观察牙髓组织切片的效果比较［J］.广东医学，2012，33(7):917－9.
［14］Tinling S P，Giberson R T，Kullar R S.Microwave exposure increases bone demineralization rate independent of temperature［J］.J Microsc，
2004，215(3):230－5.
［15］Cunningham C D，Schulte B A，Bianchi L M，et al.Microwave decalcification of human temporalbones［J］.Laryngoscope，2001，
111(2):278－82.
王林，女，硕士，副主任医师，通讯作者。

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【相关文献】
［1］杨传红，赖晃文，唐赓云，等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择［J］.临床与实验病理学杂志，1996，12(4):357－8.
［2］胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11(3):263.
［3］罗灿峤，莫木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用［J］.中国实用医药，2011，6(19):27－8.
［4］连丽琴，夏凌志，钟惠霞.三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析［J］.武警医学，2008，19(10):937－8.
［5］Yamamoto-Fukud T，Shibata Y，Hishikawa Y，et al.Effects of var-ious decalcification protocolson detection of DNAstrand breaksbyterminal dUTP nick end labeling［J］.Histochem J，2000，32(11):697－702，
［6］陈世梁，卢志承，董玉英.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用［J］.临床与实验病理
学杂志，2009，25(5):557－8.
［7］谢玲，邹丽宜，张志平，等.改良脱钙液制作脱钙骨石蜡切片与传统方法的比较［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2125 －8.
［8］Weisberg E C，Hilburn M，Johnson B，et al.Intraoperative Microwave processing of bone margins during resection of head and neck cancer［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2001，127(7):790－3.
［9］张大贵，林小芳，张普.三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响［J］.中国现代医生，2012，50(24):101－5.
［10］Cunningham C D，Schulte B A，Bianchi L M，et al.Microwave decacification of human temporal bones［J］.Laryngoscope，2001，111(2):278－82.
［11］Walsh L，Freemont A J，Hoylland J A.The effect of tissue decalcifcation on mRNAretentionwithin bone for in-situ hybridization studies［J］.Int J Exp Pathol，1993，74(3):237 － 41.
［12］Shibata Y，Fujita S，Takahashi H，et al.Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues
［J］.Histochem Cell Biol，2000，113(3):153 －9.
［13］万蕾，章锦才.不同脱钙方式观察牙髓组织切片的效果比较［J］.广东医学，2012，
33(7):917－9.
［14］Tinling S P，Giberson R T，Kullar R S.Microwave exposure increases bone demineralization rate independent of temperature［J］.J Microsc，2004，215(3):230－5. ［15］Cunningham C D，Schulte B A，Bianchi L M，et al.Microwave decalcification of human temporalbones［J］.Laryngoscope，2001，111(2):278－82.
中图分类号:R 446.6。