一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，
将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草 病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基 平板上，病菌即生长而得到纯培养。
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3．组织的表面消毒剂
（1）酒精
用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟
到1分钟），然后用灭菌水冲洗；
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（3）次氯酸钠NaClO3
由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效 果，目前多改用次氯酸钠. 消毒所用的浓度一般是3%-5%的水溶液，消 毒时间5-15分钟。
幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同 时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。
比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌 水洗8、9次。
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滤膜孔径主要有 0.22 µ m 和 0.45µ m 两种。过 滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
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5、斜面、平板培养基的制作
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条， 然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5， 冷凝后即成斜面培养基。 三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板 培养基。
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2）制作步骤
•马铃薯洗净，去皮称200g切块/条，
•1000ml水煮沸30min，
•用双层纱布滤去薯块，
•加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，
•待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， •塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
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自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH 为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
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4.1.1 斑点病病原真菌的分离
从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用
70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液
中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移臵 在琼脂培养基平板上培养。
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4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离
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从根茎维管束组织
分离病菌，可先将寄主
病部表面用70％酒精擦
Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，
只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）
含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避
免使用。
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2、植物组织和煎汁
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以 放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即 能做培养基使用。 植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微 生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养 液，如加琼脂即能制成固体培养基。 当然，必须灭菌后才能使用。
抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长
的环境，从而得到纯菌株。
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（一）目的意义
观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。
同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能 断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面 生长的腐生性真菌。 因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培 养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病 性。
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植物病原真菌的组织分离的技术与步骤：
1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成 5mm×5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。
注: 选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混 入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分 滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
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拭消毒，将表皮组织用 灭菌的解剖刀削去，然 后切取其中小块变色的 维管束组织，用升汞或
漂白粉液消毒后，用灭
菌水冲洗几次，移置培 养基面上。
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4.1.3 根腐病菌的分离
根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。
材料小的可以仿照斑点病的分离法。
材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。
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4.1.4 肉质组织中病菌的分离
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3、培养基的分装
根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管
或三角瓶中。
试管分装时，使用玻璃漏斗。 装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在 水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部， 用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼 烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正 好伸入，倾入培养基约15mL，平臵、凝固即成。
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
Hale Waihona Puke 靠在培养基上。306）每皿5块，均匀摆放，倒臵于25℃培养箱中 培养。4-5天后检查结果。写明日期、姓名等。
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各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要 根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典 型材料的分离法。
4.1.1 斑点病病原真菌的分离
4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离 4.1.3 根腐病菌的分离 4.1.4 肉质组织中病菌的分离 4.1.5 种子内病菌的分离法
多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内
病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织
分离。
如有杂菌感染可 采用“直接接种” 法，待出现症状
后，用此法再行
分离。
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4.1.5 种子内病菌的分离法
将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒
（升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培
养基平板上培养。
种子如在未破裂的 果荚内，可以不经
过表面消毒，在无
菌的条件下取出移 在培养基平板上培 养。
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稀释分离法
稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离 细菌和酵母菌等。
植物病原真菌的分离 一般很少用稀释法分 离，但有些产生大量 孢子的病原真菌和霉 菌，可以配成孢子悬 浮液稀释分离。
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方法： ① 用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子 悬浮液， ② 用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平 板培养基上， ③ 然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整 个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后 倾入融化后冷却至45℃的培养基， ④ 轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。
将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂
在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。
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典型的是担 子菌亚门大 型真菌担孢 子的分离和 获得： 担孢 子无色或有 色，浅色的 担孢子需要 成团堆积时 方能辨识， 一般是依靠 “孢子印”。
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4.2.2 土壤带菌分离法
为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可 以采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织 作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等 发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用 得较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞
蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧
去。
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（2）升汞溶液（0.1%）
配方为：升汞 1g， 浓盐酸 2.5mL， 加水 至 1000mL。 将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水 稀释。 升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加 几滴红染料。
消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情 况而异，一般3～5分钟。消毒后用无菌水冲洗3～4 次。
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二、真菌分离
植物病原菌的 分离培养，是植物 病理实验室工作中 的基本技能。
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真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌 分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯