抗生素的生物效价测定法(管碟法)

抗生素的生物效价测定法

测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。

生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。

抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。

稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。

比浊法原理及操作大致与稀释法相同。比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。

扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。扩散法有几种，或中一种叫管碟扩散法（筒称管碟法）为国际上常用的方法，在我国也作为法定的抗生素检定法。

下面我们将详细地讨论管碟法的原理和实验方法。

一、：

二、管碟法测定的设计原理及计算方法

管碟法所用的管子系用瓷、铝或玻璃制成，较好的用不锈钢制成，它是内径为6+毫米、外径为8+毫米、高10+毫米的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。

摊布固体培养基的容器可用双碟，亦可用平底下班盘。管子放在混有菌种的固体培养基上时，可用人工放置，也可用特定的管子放置器放置。

操作步骤，一般是将固体培养基放在水浴上融化，倒在双碟上，待其凝固，然后在上面再倒一层混有菌种融化培养基。待菌层培养基凝固后，在表面上放置管子，向管子中加满抗生素的稀释液，在37℃培养16~18小时，然后量取抑菌圈并进行计算。

（一）抑菌圈的形式小管中的抗生素向培养基中扩散（呈球面扩散），在此同时试验菌也开始生长。抗生素浓度高于抑菌浓度之处试验

菌不长，因此出现抑菌圈，其圈之边缘处恰好为抗生素的最低抑

菌浓度。

抑菌圈的半径（r）与下列因素有关：(1)抗生素在管中的量（M）；（2）抗生素的扩散系数（D）；（3）细菌生长达到肉眼可见的时间（T）；（4）培养基的厚度（H）。其中的定量关系可用分子扩散定律来推导，得到如下所示的公式：

logM= (1/r2+ log(C·ЛTH)

（11-1）

式中 D ——扩散系数，毫米2/小时；

—

T ——抗生素扩散时间（接近细菌

生长到肉眼可见的时间），小时；

M ——在管中抗生素总量，单位；

r ——管中心到抑菌圈边缘的距

离，毫米；

L ——管的高度，毫米；

H ——培养基的厚度，毫米；

C ——最低抑菌浓度，单位/毫米。

由于此公式相当于直线方程式（y=ax+b），（logM相当于y,1/相当于斜率a,log(C·4πDTH)相当于截矩b），因此设logM为纵标，r2为横坐标时可得截矩为log(C·4πDTH),斜率为1/的直线。

（二）测定设计原理与计算公式由公式可知logM与r2成直线关系，即抗生素总量的对数值与抑菌圈半径的平方值成直线关系，因此抗

生素的量可从抑菌圈大小来推算。这就是说，抗生素总量的多少

受最低抑菌浓度(C)、培养基厚度(H)、扩散系数(D)、和细菌生长时

间(T)的影响，例如培养基厚度减少到H/2时则抑菌圈增大，可计

算如下：

…

培养基厚度为H时

logM= (1/r2+ log(C·4πDTH)

培养基厚度为H/2时

logM= (1/r2+ log(C·4πDTH/2)

两式相减，化简可得：

r12=·log2+r2

由于πDT)为斜率的倒数、r2为原抑菌圈半径的平方值，均为已知，则增大的圈（r1）即可算出。

同理，若知细菌最低抑菌一半时，则抑菌圈的半径（r2）也将增大：

￥

r22=log2+r2

从上可知，抗生素总量的对数值与抑菌圈的平方成直线关系，因此可作定量测定。但由于抑菌圈的大小还受C、H、D、T的影响，

所以应消除这些影响才能准确测定。要消除这些影响，

可用标准品同时对照测定（即所谓相对效价设计法），

计算方法如下。

设：标准品的高单位抑菌圈为S H

标准品的低单位抑菌圈为S L

样品高单位的抑菌圈为U H

样品低单位的抑菌圈为U L

则小管听标准品总量（M）与样品总量（M’）分别为：

&

因log(C·4πDTH)为截距，在同一双碟上其数值是相等的，因此两者相减，它就被消去了。

因（1/）为直线的斜率，所以样品与标准品的效价比即等于斜率乘样品的抑菌圈的平方值与标准品抑菌圈平方值之差数。此即管碟法的标准曲线法的基础，如要消除斜率（1/）的影响，可用二剂量法，即标准品用二剂量（S H及S L）,样品也用二剂量（U H及U L）代入公式并计算之，即可消除斜率的影响。计算方法如下：