第十章亲和色谱

逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，
也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。

是亲和分离技术中最具优势的方法
混合蛋白样 品
平衡 液
含配体溶液
带有配体的树 脂珠（或胶粒）
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和作用体系

将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从

在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不
受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态
上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子 化合物。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层 析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与 抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一 般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法， 特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯

例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A (concanavalin A，Con A)与葡聚糖和甘露糖的亲
和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheat germ
agglutinin ， WGA ）与 N- 乙酰葡糖胺（ N-acetylglucosamine）的亲和结合作用较强。
（5）辅酶和磷酸酰苷

过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（ IDA ）或三 羧甲基乙二胺（ TED ）形成螯合金属盐固定在固 定相粒子表面，用作亲和吸附蛋白质的配基。

这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金
属螯合亲和色谱 (metal chelate affinity chromatography) 或 固 定 化 金 属 离 子 亲 和 色 谱 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC)。
5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料
等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择
理想的基质应符合下面的要求：
1．极低的非特异性吸附
2．高度的亲水性 3．较好的理化稳定性
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合 5．适当的多孔性 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多 孔玻璃珠等。

蛋白A不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而 且任何抗体的 Fc片断的结构都非常相似，因此蛋
白 A 可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的
结合常数有所不同。
（4）凝集素
凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶
和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，
含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖 结合的特异性不同。
-3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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配基分子的大小

选用大分子配基。 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一个 “手臂”以消除空间障
碍。
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亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂
一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶 分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上 的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降， 甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑 制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。
加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。

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配基偶联的位置

配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。

腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，
对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。

磷酸基接到载体上，对甘油醛

生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分
子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分
子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。

生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、 激素-受体等亲和作用。



具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键
亚胺二乙酸（IDA）
（8）组氨酸
在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有 弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋 白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机 理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白 质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏 水性相互作用均有可能参与亲和结合。
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配基

生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性


专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类

单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基
亲和洗脱

目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和 结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标 产物的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、 离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。

亲和色谱

亲和层析(Affinity Chromatography ，AC)是利用 生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可

Cibacron Blue 3GA(又称Reactive Blue 2) 最常用的活性色素
（7）过渡金属离子
Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、 S和O等供电原子（electron donor atom）产生配 位键，因此，可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪 唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp） 的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基 的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合 强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+ 。
混合物中高选择性地分离纯化。

一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基 （ligand），用L表示。
Kd解离常数 Keq结合常数

[E]、[L]和[E· L]分别表示蛋白质、配基和其复合
体的平衡浓度。

结合常数Keq越大，或解离常数Kd越小，表示亲
和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol，有
各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存 在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅 酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷 酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。


专一性的大分子亲和配基
免疫亲和配基

基团专一性的大分子亲和配基
亲和配基的选择



组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序 列 噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克 隆群体→氨基酸序列 SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
化蛋白质类生物大分子的有效手段。
（3）蛋白A
蛋白A（protein A）为分子量约42KD的蛋白质， 存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中，占该细胞壁构
成成分约 5 ％。蛋白 A在确定其为蛋白质之前称 A
抗原，与动物免疫球蛋白 G(immunogloblin G ， IgG) 具有很强的亲和结合作用，结合部位 IgG 分 子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将
其分为两类： 特异性配体（specific ligand） 通用性配体（general ligand）。
特异性配体

特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋
白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和
素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体
等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质 作为配体都属于特异性配体。
5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相
互作用减弱
6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失

利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作 用进行分离的技术为亲和分离技术

亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的
相互作用的物质
常见亲合作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。

通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特
异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得
到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等 优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
配基的浓度

对亲和势比较低的时候（ KL≥10-4mol/L ），增

配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要
因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤
其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到
合适的特异性配体通常需要大量的实验。
通用性配体
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某
一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种
凝集素（ lectine ）可以结合各种糖蛋白，核酸可
群特异性
亲和层析过程

找与底物专一可逆 结合的配基；

将配基通过共价键
偶联到基质；

配基与底物吸附；
洗脱目标物。
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二、亲和纯化技术


亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
些最高可达到1015 L/mol 。

低于103 L/mol，亲和结合作用太小，不能有效结 合目标。
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高；
2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差
的生物大分子；
3、纯化倍数大，产物纯度高；
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻 求稳定的层析条件；
第十章
亲和色谱
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一 路线一A 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥)
路线二
清液Hale Waihona Puke Baidu胞外产物
路线一B
包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性
细胞破碎 碎片分离
一、概述
（6）色素配基

三嗪类色素 (triazine dyes) 是一类分子内含有三
嗪环的合成活性染料,与各种需要在NAD的存在下 表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。

这类色素与NAD的结合部位相同,具有抑制酶活性 的 作 用 , 因 此 又 称 为 生 物 模 拟 色 素 (biomimetic dye)。

利用色素为配基的亲和色谱法一般称作色素亲和
色谱(dye ligand affnity chromatography)。

除脱氢酶和激酶外,三嗪类色素还与很多蛋白质具 有结合能力,如血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶
菌酶和糖解酶等,用途非常广泛。

色素与这些蛋白质结合的作用机理很复杂,有些是 疏水性相互作用,有些则是疏水性吸附和静电吸附 共同作用的结果。

这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外， 磷 酸 腺 苷 （ adenosine 5’-monophosphate ，
AMP ） 、 二 磷 酸 腺 苷 （ adenosine2’,5’diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结 构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用， 可用做这些酶的亲和配基。
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用
减弱或完成破坏。 2、pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其 它pH下，亲和作用减弱或完成破坏。 3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱 亲和作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱； 但是，疏水性相互作用增强