蛋白纯化方法—凝胶过滤色谱

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凝胶过滤色谱实验报告

凝胶过滤色谱实验报告

一、实验目的1. 了解凝胶过滤色谱(Gel filtration chromatography,GFC)的基本原理和操作方法。

2. 掌握凝胶过滤色谱在分离、纯化蛋白质等生物大分子中的应用。

3. 通过实验验证凝胶过滤色谱的分离效果。

二、实验原理凝胶过滤色谱是一种根据分子大小进行分离的技术,其基本原理是利用凝胶的分子筛特性。

凝胶是一种具有多孔结构的物质,孔径大小不一,当混合物通过凝胶时,分子大小不同的物质会被不同程度地阻滞在凝胶孔隙中,从而实现分离。

三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 蛋白质样品:牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、酵母提取物(Yeast Extract)- 凝胶色谱柱:Sephadex G-75- 缓冲液:磷酸盐缓冲液(pH 7.4)- 标准分子量蛋白质:分子量分别为6.5×10^4、1.4×10^5、2.0×10^5、4.0×10^5、6.0×10^5的蛋白质混合物2. 实验仪器:- 凝胶色谱仪- 超速离心机- 荧光检测器- 移液器- 离心管- 吸管四、实验步骤1. 准备凝胶色谱柱:将Sephadex G-75凝胶柱安装在凝胶色谱仪上,用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡凝胶色谱柱,使其达到稳定状态。

2. 准备样品:将标准分子量蛋白质混合物、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白和酵母提取物分别溶解于磷酸盐缓冲液中,制成蛋白质溶液。

3. 上样:将蛋白质溶液加入凝胶色谱柱,使样品在凝胶色谱柱中均匀分布。

4. 流动:打开凝胶色谱仪,以一定流速(如1 mL/min)进行洗脱,收集洗脱液。

5. 分析:将收集到的洗脱液进行检测,记录蛋白质的洗脱峰,并分析其分子量分布。

6. 离心:将洗脱液中的蛋白质进行离心,分离出蛋白质沉淀。

7. 质量分析:将蛋白质沉淀进行电泳、质谱等分析,验证其纯度和分子量。

五、实验结果与分析1. 凝胶过滤色谱洗脱曲线:通过凝胶色谱仪收集洗脱液,绘制洗脱曲线。

凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别

凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别

凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。

它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。

今天,我们将深入探讨这两种方法之间的区别,以便更好地理解它们的应用和优势。

一、原理1. 凝胶过滤色谱法:凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。

它利用具有特定孔径大小的凝胶填料,大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出,而小分子则能够进入孔隙而被滞留,从而实现分子的分离和纯化。

3. 凝胶渗透色谱法:凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。

它利用凝胶填料形成的三维网络结构,分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比,因此分子越大,其在凝胶中的渗透速度越快,分子越小,渗透速度越慢,从而实现分子的分离和纯化。

二、区别1. 分离原理不同:凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的,而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。

2. 分子范围不同:在凝胶过滤色谱法中,适用于分离分子量较大的物质,而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质,并且对于高分子更为有效。

3. 分离效果不同:凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果,但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。

而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。

三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子,用来检测生物大分子的分子大小和形态。

而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外,还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。

四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。

在实际科研工作中,选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。

我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估,选择合适的色谱方法进行分离和分析。

总结回顾通过本文的讨论,我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。

这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值,能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析,对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。

胶体金标记蛋白质的纯化(超迷离心法和凝胶过滤法)

胶体金标记蛋白质的纯化(超迷离心法和凝胶过滤法)

胶体金标记蛋白质的纯化(超迷离心法和凝胶过滤法)标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色,尤其是免疫电镜的染色。

纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质,未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。

其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

(一)超迷离心法根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同,离心的转速和时间也不同。

用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心(20nm颗粒用 250g;5nm用4800g20min),弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀,然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和 40nm金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清,将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量,平衡过夜后,重复离心2次,最后一次洗涤离心的沉淀,再用1%牛血清白蛋白缓冲液(含0.02mol/LNaN3)稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为 0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。

制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃,如加入50%甘油可贮于0℃以下(-18℃)1年以上。

以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金,按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同,用不同离心转速分离纯化,以白磷还原法制备的5.0 nm胶体金A 蛋白,用125000×g离心;抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白,用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀,其上为较疏松的红色沉积物,再上为透明的上清液。

附贴管底的沉淀无用,以后操作步骤中不要搅起来,仍保持其贴于管底。

弃去上清液后,用等体积的 0.0lmol/LPBS(pH7.2)溶解疏松红色沉积物,同上重复离心1次,小心移去上清液,剩余0.5ml上清液,将疏松红色沉积物溶解后,即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。

(二)凝胶过滤法凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。

简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理

简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理

简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理
凝胶过滤色谱分离蛋白质是一种非常有效的高精度蛋白质分离方法,它是在现代生物分子技术领域中被广泛应用的工艺。

它可以有效地去除病毒、抗原和多种其他污染物,提高生物系统的纯度,可用于药物研究和药物开发等多个领域。

凝胶过滤色谱分离的原理依赖于对蛋白质的分子大小,电荷和结构的分析,同时还依赖于凝胶纤维的物理属性。

在凝胶过滤色谱分离中,首先从样品中取出溶液,然后将其稀释到分离质谱仪中,在垂直于样品流动方向的静止盒子中加入预处理凝胶,并同时在样品流动路径上安排一个保护液池,同时将流动的样品溶液在冷却管中静止,使样品溶液内的蛋白质和病毒分子在凝胶纤维中逐渐凝结,形成稳定的聚集体。

经过特殊分离处理,污染物聚集体从凝胶中移出,而相应的蛋白质分子保留在凝胶内。

经过特定条件的改变,聚集体不断游离,并以不同的速度由凝胶移出,形成一条梯度图,不断改变分离系统的压力和温度,可以有效地改变梯度图的形状,以实现最佳的分离效果。

最终的分离结果可以非常清晰地显示出蛋白质的迁移路径。

分离结果可以用于分析蛋白质的数量和结构,也可以用于药物的研发和临床应用的评估。

因此,凝胶过滤色谱分离法是一种高精度、有效的蛋白质分离方法,可用于从样品中有效地提取蛋白质,具有很强的应用价值。

它不仅可以有效地滤除污染物,提高蛋白质质量,而且能够有效掌握蛋白
质的结构和组成,为药物研究和药物开发提供了灵活的分析工具,为科学家和医学界提供帮助。

总之,凝胶过滤色谱分离蛋白质可以有效提取高纯度的蛋白质,且具有高精度的分离能力,是现代生物分子技术研究中不可缺少的生物分子分离手段。

蛋白质分子量测定

蛋白质分子量测定

蛋白质分子量测定方法目前,蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种:年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。

一、粘度法一定温度条件下,高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性,随着分子量的增大,聚合物溶液的粘度增大。

通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化,即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

该方法操作简单、设备价格较低,通常不需要标准样品,但无法测定聚合物的分子量分布。

粘度法所需设备:恒温槽、乌倍路德粘度计。

二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中,分子量不同的聚合物分子,由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。

分子量较大的分子,渗入凝胶微孔较浅,随洗脱液流动速度较快,因而先流出色谱柱;相反,分子量较小的聚合物分子后流出。

通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积,并与标准样品比较,即可计算聚合物的分子量,并估算其分子量分布。

凝胶层析技术操作方便,设备简单,样品用量少,而且有时不需要纯物质,用一粗制品即可,目前已得到相当广泛的应用。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性,在pH6—8的范围内,线性关系比较好,但在极端pH时,一般蛋白质有可能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过5%时,测得分子量比真实的要大,铁蛋白则与此相反,测得的分子量比真实的要小。

凝胶过滤层析法所需设备:层析柱、紫外分光光度计。

三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称,它是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质),使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线,可求得未知物的分子量。

SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法,实验成本较低,仪器设备也相对很简单,一套电泳装置即可。

常用的蛋白质纯化方法和原理

常用的蛋白质纯化方法和原理

常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步,纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。

常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。

下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。

1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。

该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低,使其从溶液中沉淀出来。

应用盐析法时,需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解,然后逐渐加入盐使其过饱和,蛋白质便会析出。

最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离,得到纯化的蛋白质。

2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。

凝胶通常是聚丙烯酰胺(也称作Polyacrylamide)或琼脂糖。

研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上,较小的蛋白质能够通过pores,较大的分子则被排出。

通过选择不同大小的凝胶孔径,可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。

凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流,将蛋白质与其他杂质分离开来。

3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。

离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。

在离子交换色谱法中,样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质,带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应,吸附在基质上。

为了获得纯化蛋白质,需要通过梯度洗脱,逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度,使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。

4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。

配体可以是天然物质,如金属离子、辅酶或抗体,也可以是人工合成的结构。

在亲和色谱法中,样品溶液经过含有配体的固定相,与配体发生特异性相互作用,蛋白质与其它组分分离。

然后可以通过改变某些条件(如pH、温度或离子浓度)来洗脱纯化的蛋白质。

凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱

主要缺点:
分辨率及峰 容量均相对 较低。
凝胶过滤色谱的分离原理
◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱 如果溶质分子的尺寸大于孔径,则只能从孔旁 中进。 流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的 ◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。 孔体积。这样,分子体积不同的混合物一起进 ①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中, 入柱端时,经过淋洗、扩散,总是体积大的分 即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。 子先流出柱子,小分子量即体积小的分子印刻 ②分子体积的大小,造成了在孔中扩散途径的 进入凝胶的孔中,使其行程延长而滞后流出, 差异,溶质分子只能进入尺寸比它大的孔; 从而使分子体积不同的分子得以分离。
凝胶过滤色谱的应用
• 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基 酸锌螯合物螯合率的差异性
采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两 种氨基酸锌螯合物的螯合率,发现该法测定结果与其他测 定方法分析结果一致,表明此法适用于测定蛋氨酸锌的螯 合率 但测定苏氨酸锌螯合物的螯合率时,测定结果与其他测定 方法分析结果不一致,结合葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定 过程,表明此法不适用于测定苏氨酸锌的螯合率。
常见凝胶过滤色谱填料
• 表11-8列出了常见的无机型亲水凝 胶,尽管牌号各异,但其化学本质 几乎均是二醇型化学键合硅胶。 二醇型化学键合硅胶。 二醇型化学键合硅胶

见书本247页 页 见书本
凝胶过滤色谱的应用
• 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性
利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解 液,水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量 分级,根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线,并根据标准曲线判断分离 组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定 法(FRAP)、二苯基苦基苯肼法(DPPH)以及金属 铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化 能力,并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC 分离和氨基酸组成分析

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足
中国自古以来就是一个科学大国,科学技术在古今中外都有着重要的意义。

凝胶过滤色谱技术作为一项先进技术,被大量用于蛋白质的分离纯化,但也存在不足之处。

凝胶过滤色谱技术的原理是利用物质的分子量差异,在同一胶层中进行分离。

蛋白质分子量可能较大,在凝胶过滤色谱中易受到局限,无法得到满意的纯度结果。

此外,蛋白质会通过胶层中的游离位点而产生非特异性干扰,导致纯度较低。

此外,凝胶过滤色谱对前期样品稀释的要求较高,一般需要在小于1 mg/ml的浓度下实验,这也是分离纯化出蛋白质的最佳条件,但在实际应用中,样品往往不能满足这个要求,而样品的稀释过程也比较繁琐,增加了使用凝胶过滤色谱分离纯化蛋白质的难度。

从另一方面来说,凝胶过滤色谱技术在分离纯化蛋白质方面也有许多优势。

首先,凝胶过滤色谱在进行分离纯化蛋白质时不改变蛋白质的结构,而且一般不涉及任何复杂的设备,可以节省大量的时间和成本,使其更适合于实验室的实际应用。

而且凝胶过滤色谱具有很高的分离精度,可以分离出高纯度的蛋白质,也可以控制多种因素,有效减少污染,为实验加速。

因此,凝胶过滤色谱技术在分离纯化蛋白质方面有许多不足,但其优势也是不可忽视的。

在实际应用中,科研人员可以结合对蛋白质结构和分离纯度的要求,选择恰当的分离纯化技术,以获得更满意的结果。

因此,凝胶过滤色谱仍然是蛋白质的分离纯化技术中的重要选
择。

总之,凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质方面存在不足之处,但其优势仍然是不可忽视的。

研究人员需要结合不同的情况,采取合理的技术手段,以获得更满意的结果。

凝胶色谱柱的使用

凝胶色谱柱的使用

凝胶色谱柱的使用凝胶色谱柱(Gel chromatography column),又称为凝胶过滤色谱柱,是一种常用于蛋白质和多肽分离纯化的柱层析技术。

它是根据溶质在凝胶颗粒孔隙和凝胶颗粒表面之间的扩散速率不同来实现分离的。

凝胶色谱柱由内核和包覆层构成。

内核是由纤维素、琼脂糖、琼脂和聚丙烯酰胺等材料制成的颗粒,颗粒大小一般在10-300微米之间。

内核是柱层析的主要分离介质,具有一定的孔隙结构,可以根据溶质的分子量来选择孔径大小。

包覆层是一层较细的凝胶层,在内核表面涂覆各种高分子材料,通过改变包覆层的化学性质,可以调控分离过程中的选择性和分离效果。

1.样品制备:准备待分离的样品溶液,通常需要用缓冲液进行稀释和调整pH值。

如果样品中含有高浓度的盐类或有机溶剂等,需要进行脱盐或柱外固相萃取处理。

2.样品加载:将样品溶液加载到凝胶色谱柱上,可以通过重力流动或使用泵进行加样。

3.柱洗脱:用缓冲液进行柱洗脱,一般要满足样品的最佳分离条件。

可以使用单一缓冲液或梯度洗脱,根据需要选择合适的洗脱方式。

4.收集分离物:根据需要,收集分离物进行后续分析或纯化。

1.蛋白质纯化:凝胶色谱柱可以根据蛋白质的分子量进行分离,常用于蛋白质的粗提和富集。

2.多肽纯化:凝胶色谱柱可以根据多肽的大小和亲水性进行分离,常用于多肽的富集和纯化。

3.药物研发:凝胶色谱柱可以用于药物分子的纯化和分析,有助于药物研发过程中的药物筛选和性质表征。

4.生物分析:凝胶色谱柱可以用于生物样品中复杂成分的富集和纯化,有助于生物样品的分析和研究。

1.分离效果好:凝胶色谱柱可以通过调控柱层析介质的孔隙大小和分离效果,达到较好的分离效果。

2.操作简单:凝胶色谱柱的操作相对简单,不需要复杂的设备和操作流程。

3.适用范围广:凝胶色谱柱适用于不同分子量和化学性质的样品,可以满足不同的纯化需求。

1.分离速度慢:由于样品分子需要通过凝胶层的扩散来实现分离,凝胶色谱柱的分离速度较慢。

蛋白质分离纯化的一般原则

蛋白质分离纯化的一般原则

蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质是生物体内重要的功能分子,它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。

蛋白质的纯化和分离是研究蛋白质结构和功能的基础。

本文将介绍蛋白质分离纯化的一般原则和方法。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

蛋白质具有不同的分子量、电荷、溶解性、亲疏水性等特性,可以通过这些特性来实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的第一步是提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有多种,常见的包括机械破碎、超声波破碎、溶剂提取等。

提取蛋白质的目的是将其从细胞或组织中释放出来,为后续的分离纯化步骤做准备。

蛋白质的分离纯化可以通过多种方法来实现。

其中最常用的方法是色谱技术。

色谱技术基于蛋白质的物理化学性质,将混合溶液中的蛋白质分离开来。

常见的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、逆相色谱等。

凝胶过滤色谱是一种基于蛋白质分子量的分离方法。

其原理是通过孔径大小选择性地分离不同分子量的蛋白质。

凝胶过滤色谱常用于蛋白质的初步分离和浓缩。

离子交换色谱是一种基于蛋白质电荷的分离方法。

其原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的相互作用来实现分离。

离子交换色谱可以根据蛋白质的电荷性质选择性地分离不同电荷的蛋白质。

亲和色谱是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用来实现分离的方法。

亲和色谱可以利用蛋白质与亲和基质之间的特异性结合,选择性地分离目标蛋白质。

逆相色谱是一种基于蛋白质亲疏水性的分离方法。

其原理是利用蛋白质与逆相基质之间的亲疏水作用来实现分离。

逆相色谱可以根据蛋白质的亲疏水性选择性地分离不同性质的蛋白质。

还有一些其他的蛋白质分离纯化方法,如电泳、超高速离心、超滤等。

这些方法在特定的实验条件下可以实现蛋白质的分离纯化。

蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。

通过选择合适的分离纯化方法,可以有效地分离出目标蛋白质,并去除其他杂质。

蛋白质的纯化程度越高,其质量和活性也就越好,对于后续的研究和应用具有重要意义。

蛋白质色谱分离技术

蛋白质色谱分离技术

蛋白质色谱分离技术
蛋白质色谱分离技术是一种常用的蛋白质分离纯化技术,主要依据蛋白质的特定位点的差异进行分离。

该技术主要包括以下几种:
1. 凝胶过滤色谱(Gel filtration chromatography,GFC):也称为尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)。

这种技术根据分子的流体动力学体积或大小差异来进行分离,适用于分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。

同时,这种技术也可以用于测定蛋白质的分子量。

通过单一凝胶床可以将分子大小相差25%的样品完全分开。

此外,凝胶过滤色谱还可以用于样品的浓缩和脱盐去热源和脱色等。

2. 亲和色谱:这是蛋白质检测中最专一的分离技术,可以从复杂的混合物中直接分离出目标蛋白质分子。

3. 疏水相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC):这种技术利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异,在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的。

其分离机制类似于反相液相色谱,只是用水性缓冲液代替了有机溶剂。

每种蛋白质色谱分离技术都有其独特的应用和限制,因此在选择和应用时需要根据具体情况进行考虑。

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足

凝胶过滤色谱在分离纯化蛋白质的不足近几十年来,分离纯化蛋白质的科学研究取得了巨大的进步,从古老的技术到现代技术。

凝胶过滤色谱(GFC)法是主要的纯化技术之一,但它在分离纯化蛋白质中也存在一定的不足。

首先,凝胶过滤色谱法适用于大分子量蛋白质的分离纯化。

它可以用于分离大分子量蛋白质,但小分子量蛋白质很难被分离出来,因为它们太小,无法保留在凝胶滤膜上。

此外,GFC法通过凝胶过滤技术来快速分离大分子量蛋白质,但它不能用于分离小分子量或高纯度蛋白质,从而导致分离的蛋白质的纯度较低。

其次,GFC法不能有效地除去可能存在的杂质成分。

GFC法仅仅是通过凝胶过滤技术除去蛋白质悬液中的杂质,而不能有效地除去杂质物质,这可能会降低蛋白质的纯度。

此外,GFC法对体外实验效率不高。

由于GFC法需要将样品悬液通过柱体内部的复杂运动,因此能够有效地将样品纯化出来,但它的速度较慢,且体外结果不太准确,可能会影响最终的结果。

最后,GFC法的成本比较高。

由于GFC法的复杂技术和设备需要,可能会导致实验成本较高。

总之,凝胶过滤色谱法是一种重要的纯化技术,可用于大分子量蛋白质的分离纯化。

然而,它存在一定的不足,如不能有效地除去杂质成分、实验效率不高、以及高成本等,这些都会降低最终分离纯化蛋白质的效果。

因此,未来需要研发更加简单高效的分离纯化蛋白质的新技术,以改善现有纯化技术的不足。

在未来的研究中,应当重点关注以下两个方面:一是实验速度,即如何提高GFC法的实验速度;二是结果准确性,即如何提高GFC法的结果准确性。

首先,应该研发一种新的无需凝胶过滤的纯化方法,以提高实验速度;其次,也可以对现有GFC法进行改良,以提高结果准确性;另外,还应该开发更加精确和有效的杂质除去技术,以提高最终蛋白质纯度。

综上所述,凝胶过滤色谱法在分离纯化蛋白质方面具有一定的不足,但随着技术的发展,这些不足也可以通过研究来解决。

未来,可以期待更加简单高效的分离纯化蛋白质技术的出现,以改进现有的分离纯化技术。

体积排阻色谱和蛋白分离纯化

体积排阻色谱和蛋白分离纯化

体积排阻色谱和蛋白分离纯化在生物科学领域,蛋白质的分离纯化是至关重要的研究环节。

体积排阻色谱法作为一种常用的蛋白质分离技术,具有广泛的应用前景。

本文将深入探讨体积排阻色谱法的原理、应用以及面临的挑战。

一、体积排阻色谱法的原理体积排阻色谱法,也称为凝胶过滤色谱法,其基本原理是利用固定相的孔径大小对样品进行分离。

在色谱柱中,大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒的内部,而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。

随着流动相的流动,大分子蛋白质将比小分子蛋白质更早地流出色谱柱,从而实现样品的分离。

二、体积排阻色谱法的应用体积排阻色谱法在蛋白质分离纯化中具有广泛的应用。

首先,该方法可以用于分离和纯化各种生物分子,如蛋白质、多糖和核酸等。

其次,体积排阻色谱法可以用于蛋白质的分子量测定和分子量分布研究。

此外,该方法还可以用于蛋白质的脱盐、脱水和脱磷等预处理过程。

三、面临的挑战尽管体积排阻色谱法在蛋白质分离纯化中具有广泛的应用,但仍面临一些挑战。

首先,对于一些具有相似分子量或性质的蛋白质,分离效果可能不佳。

其次,对于一些具有较大分子量的蛋白质,可能会在凝胶颗粒内部形成聚集物,影响分离效果。

此外,对于一些具有不稳定性质的蛋白质,可能会在色谱柱中发生变性或降解。

四、未来展望为了克服体积排阻色谱法面临的挑战,未来的研究可以关注以下几个方面。

首先,开发新型的固定相材料,以提高对相似分子量或性质的蛋白质的分离效果。

其次,优化色谱柱的制备工艺,以提高对大分子量蛋白质的分离效果。

此外,研究蛋白质在色谱柱中的行为,以了解其变性和降解机制,为提高蛋白质的稳定性提供理论支持。

总之,体积排阻色谱法作为一种常用的蛋白质分离技术,具有广泛的应用前景。

尽管面临一些挑战,但通过不断的研究和改进,相信该方法在未来的蛋白质分离纯化中将发挥更加重要的作用。

蛋白质多肽液相色谱纯化方法简介

蛋白质多肽液相色谱纯化方法简介

10-40
Sephadex G-100
4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G100 superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150
5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G150 superfine 5000-150000 10-40
表 2 样品中有害杂质及去除办法
杂质
害处
预防措施
颗粒物 堵塞柱子/增大反压力
0.45-0.22 微 米 膜 过 滤 ; 10000 g 离 心 10-15 分 钟 ; 细胞匀浆,4000-5000 g 离心 30 分钟。
脂类
封 闭 介 质 配 基 / 导 致 沉 淀 10000 g 离心 10-15 分钟;若目标分子稳定,用有机溶剂
1.纯化的一般目标和方法 首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉
淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品 然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的
杂质,此步最关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。 经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除
对于等电点小于 5.0 的酸性蛋白质,推荐使用阴离子交换,对于等电点大于 7.0 的碱性蛋白 质,推荐使用阳离子交换。
两种模式:一种使目的蛋白结合凝胶,通过梯度洗脱;一种使目的蛋白不结合凝胶,而大部 分杂质结合凝胶,则穿过液中含有目的蛋白。
column chromatography(柱色谱) batch chromatography(批色谱) 3、疏水作用色谱 利用蛋白质、多肽在高盐存在下,可以结合疏水凝胶,而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实 现分离。 4、亲和色谱 利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如:酶-底物,酶-抑制剂,糖 蛋白-凝集素,抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱,用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组 氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged 重组蛋白。 亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色 谱均为组别亲和色谱(同一配基可以结合许多种蛋白质)。 5、反相色谱 常用于蛋白质、多肽的 HPLC 分析,以及多肽的精细制备分离,分辨率极高,可以分离两种仅 相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素(angiotensin)的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离 。同一个样品在同一 Source 30 RPC 柱上进行分离,由于色谱条件进行了改变,色谱图截然不同, 说明反相色谱具有高度的选择性。

“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告

“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人:XXX 时间:XXXX 地点:XXXX 温度:20℃实验目的:①理解凝胶过滤层析的原理。

②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。

③学会分析洗脱峰峰型。

试验方法与过程:1.装柱①固定层析柱,柱内装1/2双蒸水,双蒸水下降到1/4时,关闭出口。

②搅拌凝胶浆液,用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱,打开出口,让凝胶沉降。

③装至柱内有2/3凝胶,上层保留至少0.5cm的水。

2.平衡双蒸水平衡柱,管口上接恒流泵、下管接检测仪入口,控制流速。

观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min,暂停恒流泵。

3.加样吸取5%丙酮溶液500ul,沿柱壁缓慢加入,控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内,用1ml双蒸水冲洗壁上的样品,在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。

4.洗脱凝集打开恒流泵开关,监视紫外检测仪的情况,待丙酮全部流出后加入,加入蛋白质混合物,监视紫外检测仪情况,开始出现上升即开始收集流出液。

蛋白质样品全部流出后,用双蒸水冲洗凝胶。

原始数据:图一:从左到右第一个峰为丙酮,第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。

结果处理与分析:①根据图像得As略大于1,说明装柱压力不足,可能滤网内有空气进入。

②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件,所以不能分析到分配系数Kd。

③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动,可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口,导致空气进入。

④加入样品后出现两个峰,说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。

讨论:1.注意事项:一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖,不能使之暴露于空气中;保证所灌凝胶中没有气泡,当有气泡和凝胶有明显分层时3,应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。

2.经验和心得:用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时,一定要沿管壁边旋转边缓慢加入,防止加入时产生压力太大,使凝胶柱上表面不平整;用滴管比用移液枪加样品好,因为滴管产生的压力小。

蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法

蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法

蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法在进行蛋白质研究时,首先需要选择一套合适的蛋白分离和蛋白纯化方法来获取高纯度的生物制品,来进行下一步的研究。

由于蛋白质具有颗粒大且不同蛋白质分子大小不同等特点,因此可以根据蛋白质分子大小不同而进行分离,这种分离方法有透析、超滤、离心和凝胶过滤,常包含在一些蛋白分离公司的服务中。

凝胶过滤是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一,也称为分子排阻层析或分子筛层析。

凝胶过滤可以利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按照分子大小分开,从而达到分离的目的。

在一些蛋白分离公司的服务中,凝胶过滤层析法常与其他层析方法配合使用。

1、凝胶过滤层析法的基本原理凝胶过滤层析法的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱,柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶,为惰性的多孔网状结构物质。

当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入其内部,而是被排阻在凝胶颗粒外部,在颗粒之间的空隙中向下移动,并最先流出柱外。

小分子物质能进入凝胶颗粒内部,因此流程较长。

这样不同大小的分子因所经路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。

美迪西是一家医药研发外包服务公司,提供蛋白质分离纯化技术服务,可以根据客户要求,提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务,并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。

凝胶过滤层析法用于蛋白分离和蛋白纯化,具有操作条件温和,适用于分离不稳定的化合物的特点。

且凝胶颗粒不带电荷,不与被分离物质发生反应,因此溶质回收率接近100%,而且设备简单、分离效果好、重现性强,凝胶柱还可以反复使用,所以该方法被广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等试验中。

2、凝胶过滤层析法纯化重组人干扰素α2b的研究将凝胶过滤层析方法用于通过基因工程方法获得的工程菌种纯化,可以制备高纯度的样品,提高生物活性,为进一步开展药学研究和长效制备提供了依据。

凝胶过滤色谱原理

凝胶过滤色谱原理

凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。

它基于样品分子在凝胶基质中的大小排列来实现分离。

在凝胶过滤色谱中,通常使用多孔度不同的凝胶基质,如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

这些凝胶基质具有规则的孔隙结构,可以限制分子在凝胶中的自由扩散。

较大的分子将被阻挡在孔隙之外,而较小的分子则能够进入凝胶内部。

样品通常在一定浓度的缓冲液中进行注入,缓冲液的选择要使得待分离的分子稳定、水溶性好。

样品溶液在凝胶表面形成一个样本区,然后逐渐渗入凝胶内部。

在样本渗入过程中,凝胶基质将限制大分子的运动,使其停留在凝胶表面或孔隙之外,而较小的分子能够进入凝胶内部,逐渐向凝胶深处扩散。

最终,分子根据其大小在凝胶中被分离成不同的区带。

较大的分子留在凝胶的近表面区域,而较小的分子则可以进入凝胶离凝胶表面较远的区域。

因此,在从凝胶中洗脱样品时,先洗脱出较小的分子,然后依次洗脱出较大的分子。

凝胶过滤色谱广泛应用于生物大分子的纯化和分析。

它可以用于分离蛋白质、核酸、多肽等生物大分子,并且对样品的体积要求较小。

同时,凝胶过滤色谱的操作相对简单,且不需要高压。

因此,它成为了生物化学和生物制药领域中不可或缺的技术之一。

蛋白纯化凝胶过滤层析法

蛋白纯化凝胶过滤层析法

蛋白纯化凝胶过滤层析知识里的冰山一角,本来搜索一叠一叠的资料,想完整的呈现知识的一浅一深。

但是知识如海,总得慢慢咀嚼消化,扎实脚印。

开始的节奏刚刚响起,那就先慢慢的认识这些最基本的知识点,本文简述了蛋白纯化凝胶过滤层析的定义、原理以及应用,了解于心,为后续理解更广阔的知识提供肩膀,所以,现在,当务之急,咀嚼再精确细化蛋白纯化凝胶过滤层析的基础知识。

——慢慢地一直走,只是不回头的向前走凝胶过滤层析又称为分子筛层析、凝胶渗透层析等,是一种按照样品组分中分子的大小进行样品分离的液相色谱方法。

固定相如琼脂糖、聚丙烯酰胺等,具有分子筛的作用,以惰性的葡聚糖凝胶作为柱填料应用最广泛,凝胶颗粒为珠状、形成很多孔穴的立体网状结构。

流动相为样品溶液,流动相组分中分子的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。

当不同分子大小的样品同时流经凝胶层析柱时,比孔穴孔径大的分子不能进入到凝胶孔内部,被排阻在孔外,随流动相向下流动,最先流出柱子;而较小的分子渗透进入凝胶孔内部,流动速度慢,路程长,最后流出;而分子大小介于两者之间的样品在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,流出时间蛋白纯化凝胶过滤层析 我只是在不停的走着 走过山,走过水,有了奔跑的力量介于两者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。

(1)凝胶颗粒的大小凝胶颗粒一般都是球形,颗粒大小通常以颗粒目数或者直径来表示,柱子的分辨率和样品的流速与凝胶颗粒的大小密切相关,颗粒大,孔径大,流速快,但分离效果差;颗粒小,孔径小,流速慢,分离效果好。

(2)分级分离范围和排阻极限分配系数是指某个组分在固定相和流动相中分配的分子浓度比。

样品中的大分子物质和小分子物质在凝胶过滤时,在分配系数上有显著差异,这种分离称为组别分离。

如果样品中的分子量比较接近,这种分离叫分级分离。

在凝胶选择时,应该根据样品中的不同分子量选择不同型号的凝胶,不同型号的凝胶具有不同的分级分离范围,如果待分离样品的分子量在凝胶的分级分离范围内,用这种凝胶可以得到较好的线性分离。

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活性蛋白整体方案
凝胶过滤色谱
摘要:本文主要讲解了凝胶过滤色谱法(分子筛)在蛋白纯化实验中的应用,包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。

基本原理
凝胶过滤色谱蛋白纯化法,又称为空间排阻色谱,分子筛等。

其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。

当样品从色谱柱的顶端向下运动时,大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱;而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中,且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同,分子量越大,流出时间就越早,最终分离分子大小不同的蛋白质。

凝胶过滤色谱原理
通常,多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的,交联程度决定凝胶颗粒的孔径。

常用的色谱基质有:葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、聚丙烯酰氨凝胶(Bio-Gel P)等。

高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子,或是除去低分子量缓冲液成分和盐,而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。

选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。

实验方案设计
1.凝胶介质的选择
凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶,同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。

比如,如果是要将目的蛋白和小分子物质分开,可以根据他们分配系数的差异,选用Sephadex G-25和G-50;对于小肽和低分子量物质的脱盐,则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4;如果
活性蛋白整体方案
是分子量相近的蛋白质,一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。

具体凝胶过滤色谱介质应用如下:
常用凝胶过滤色谱介质的分离范围
凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103
Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B
1~5
1.5~30
4~150
5~600
10~4000
60~20000
Sepharose2B
Bio-Gel P-4
Bio-Gel P-10
Bio-Gel P-60
Bio-Gel P-150
Bio-Gel P-300
70~40000
0.5~4
5~17
30~70
50~150
100~400
2.凝胶介质的预处理
凝胶在使用前应用水充分溶胀(胶:水=1:10),自然溶胀的耗时较长,可采用加热的方法使溶胀加速,即在沸水浴中将凝胶升温至沸,1~2h即可达到溶胀。

在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液,搅拌,静置,倾去上层混悬液,除去上清液中的凝胶碎块,重复数次,直到上清澄清为止。

3.色谱柱的选择
色谱柱的体积和高径比与色谱分离效果密切相关,凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径以及柱比的选择必须根据样品的数量,性质和分离目的进行确定。

组别分离时,大多采用2~30cm长的色谱柱,柱床体积为样品溶液体积的5倍以上,柱比一般在5~10之间;而分级分离一般需要100cm左右的色谱柱,并要求柱床体积大于样品体积25倍以上,柱比在20~100之间。

4.凝胶柱的填装
凝胶色谱柱与其它色谱方法不同,溶质分子与固定相之间没有力的作用,样品组分的分离完全依赖于他们各自的流速差异。

装住时关住柱子下口,在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液,然后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌均匀,缓慢并连续的一次性注入柱内。

待凝胶沉积约5厘米左右时,打开柱子下口,控制流速在1ml/min。

5.样品的处理与上样
根据样品的类型和纯化分析,需要选择合适的缓冲液,为了达到良好的分析效果,上样量必须保持在较小的体积,一般为柱床体积的1%~5%,蛋白质样品上样前应进行浓缩,使样品浓度不大于4%(样品浓度与分配系数无关),但需要注意的是,较大分子量的物质,溶液粘度会随浓度增加而增大,使分子运动受限,影响流速。

上样前,样品要经滤膜过滤或离心,除去可能堵塞色谱柱的杂质。

6.洗脱与收集
凝胶过滤色谱的缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液即可,主要考虑俩个方面的原因:蛋白的溶解性和稳
活性蛋白整体方案
定性。

所用的缓冲液要保证蛋白质样品在其中不会变性或沉淀,PH应选在样品较稳定、溶解性良好的范围之内,同时缓冲液中要含有一定的盐(NaCL),对蛋白质起稳定和保护作用。

洗脱过程中始终保持一定的操作压,流速不可过高,保持在0.5~3.0mL/min即可。

案列介绍
AKTA凝胶过滤色谱分离蛋白质
材料
色谱介质:Sephacryl S-200,蛋白质分离范围(5~250)×103
色谱柱:XK16/60预装柱
色谱设备:AKTA Explorer
混合样品:含单克隆抗体,分子量180000;牛血清白蛋白(68000),溶菌酶(14000)
NaOH0.5mol/L
NaCl200mmol/L
PB20mmol/L
PH7.0缓冲液
方法
1.凝胶除菌处理
超纯水冲洗柱子后,用0.5mol/L NaOH正向冲洗柱,流速3mL/min,冲洗3柱体积
2.平衡
NaOH处理完毕后,用超纯水冲洗2柱体积,接着用含200mmol/L NaCl和20mmol/L PB的7.0PH缓冲液冲洗5~10倍柱体积
3.上样
平衡完毕后,选择样品泵进行上样,上样流速3mL/min,上样体积为1mL
4.洗脱
上样结束后,用平衡缓冲液进行洗脱
5.清洗与保存
纯化结束后,用0.5mol/L NaOH反向冲洗2柱体积,冲洗时间30~60min,冲洗结束后,用超纯水正向冲洗5柱体积,再用20%乙醇冲洗3柱体积,然后拆下柱子,俩端封死,低温保存。

问题分析和解决方案
1.色谱分离前如何净化样品
在色谱分离前,对样品进行离心和过滤,离心能除去大部分块状物,如果离心后样品仍不清澈,可用滤膜过滤。

由醋酸纤维薄膜或PVDF材料制成的滤膜能够非特异性的结合少量蛋白。

2.溶液交换不彻底
严格控制上样体积,上样体积不超过柱体积30%。

若样品溶液体积较多,可以分多次上样,注意每次上样时间间隔,可根据电导色谱峰确定下一次上样时间。

3.分辨率不高
1)提高装柱质量,使色谱柱装填匀实;
2)提高柱床高度;
活性蛋白整体方案
3)控制上样体积,最大上样体积不超过柱床体积5%;
4)控制样品黏度与洗脱溶液黏度保持一致;
5)根据样品特点选择合适的洗脱溶液,调节洗脱溶液的离子强度或亲水性;
6)选择合适的凝胶柱(如何选择请参照上文)
4.色谱峰对称性差
1)提高装柱质量,装柱匀实——若柱装的太松,容易引起拖尾,装的太紧,会引起前沿;
2)柱较脏,再生色谱柱
5.肩峰出现的原因及解决方法
1)柱床松动,重新装柱或反向冲洗柱
2)柱筛板堵塞,超声清洗筛板
3)柱干裂,重新装柱。

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