HPLC测定有关物质和含量方法验证小结
HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质
目录摘要 (4)Abstract (4)引言 (5)1. 仪器与试剂 (6)仪器 (6)试剂 (6)2. 检测方式 (6)色谱条件 (6)测定方式 (7)供试品溶液配制 (7)样品的测定 (7)实验结果 (7)3. 方式学验证 (7)方式专属性 (8)目的 (8)操作方式 (8)可同意标准 (8)方式专属性测试结果 (8)样品图谱如下 (9)系统适应性实验 (10)目的 (11)操作方式 (11)可同意标准 (11)实验结果 (11)检测限测试 (11)目的 (11)操作方式 (12)可同意标准 (12)实验结果 (12)最小定量限测试 (12)目的 (12)操作方式 (12)可同意标准 (12)实验结果 (12)验证范围的线性 (13)目的 (13)操作方式 (13)可同意标准 (13)线性数据 (13)验证范围内的方式周密度 (14)目的 (14)操作方式 (15)可同意标准 (15)方式周密度测试数据 (15)4.讨论 (15)检测波长的确信 (15)色谱柱的选择 (16)流动相的选择 (16)5.结论 (16)参考文献 (16)致谢.............................................................................................................................. 错误!未定义书签。
HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质摘要目的：确保匹可硫酸钠有关物质检测方式准确、重现并耐用，为成立查验操作程序提供依据。
方式：采纳高效液相色谱法( HPLC)测定匹克硫酸钠有关物质，以Boston C18柱(250mm×，5μm）作为分析色谱柱，以乙腈为流动相A,以mol·L-1磷酸盐溶液（用NaOH调PH值至）为流动相B;流速为·min-1，进样量20μL，检测波长为263nm，柱温30℃；结果：该方式重复性较好，周密度高，匹可硫酸钠有关物质4，4-（2-吡啶亚甲基）双酚浓度在μg·mL-1 ～294μg·mL-1范围内线性良好（r=）；结论：本文所成立的高效液相色谱法检测匹可硫酸钠有关物质，方式简捷、省时，结果准确靠得住，可成为匹可硫酸钠更科学的的质量操纵依据。
HPLC测定蛋白质含量方法验证
A：0.1%三氟乙酸的水溶液
B： 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液
含量计算公式
供试品蛋白质含量（ug/ml)= CR×AX×nX
AR×nR
式中 CR为复溶所得标准品溶液的蛋白质含量， ug/ml； AR为标准品溶液的平均峰面积； AX为供试品溶液的平均峰面积；
nR为标准品溶液的稀释倍数；
nX为供试品溶液的倍数；
/
/ 原液批2 成品批4 成品批5
标准品
标准品 供试品 供试品 供试品
150
300 300 300 150
3715.15 3722.89
3478.19 3500.13 3424.81 3434.33 4513.68 4538.38 4273.84 4333.33
1.27
0.93 1.84 1.28 1.26
25.511
25.537 25.561
25.534
25.567 25.581
0.032
0.077 0.062
0.056
0.061 0.033
原液批2
成品批3 成品批4 成品批5
供试品
供试品 供试品 供试品
300
300 150 75
25.554
25.538 25.579 25.564
25.544
25.536 25.667 25.818
方法比较（lowry与HPLC）
批序号
原液批1 原液批2 原液批3 原液批4 原液批5 原液批6 原液批7 原液批8
lowry法（ug/ml)
1477 1393 1432 1466 1389 1456 1395 1428
HPLC法(ug/ml)
1417 1358 1379 1413 1327 1415 1352 1386
含量和有关物质方法验证
供试液3份
每份2针；
每份2针；
每份3针
平均回收率均应在80%-120%之间，9个回收率RSD＜10%
检测限与定量限
均指试样中的被分析物能够被检测到的最低量；检测限不一定要准确定量；定量限测定结果应具有一定的准确度和精密度
1%对照检测限、定量限
基线1针；
检测限2针；
定量限6针
仪器精密度
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
1%对照液仪器精密度
进6针
峰面积Rபைடு நூலகம்D≤2.0%
供试液仪器精密度
进6针（同系统适用性）
峰面积RSD≤2.0%，保留时间RSD≤1.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
杂质含量RSD≤15%
中间精密度
同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度
含量方法学验证主要包括：
系统适用性、方法专属性、精密度（仪器精密度、方法精密度和中间精密度）、线性、准确度、溶液稳定性和耐用性。
试验内容
概念
溶液配制份数
进样针数
评定标准
系统适用性
系统适用性是对分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等整个系统进行评估的指标
供试液1份
进6针
主峰峰面积RSD≤2.0%，主峰保留时间RSD≤1.0%
仪器精密度（同系统适用性）
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
供试液1份
进6针
6份供试液峰面积RSD≤2.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
6份供试液响应因子RSD≤2.0%
有关物质方法验证
有关物质方法验证有关物质方法验证（以hplc法为例）（1）系统适用性试验系统适应性试验主要就是实地考察主成分与杂质的拆分情况以及主峰参数信息，例如理论塔板数、拖尾因子、拆分度等，均应当合乎测量建议。
空白溶液、自身对照溶液、供试品溶液各进1针。
系统精密度自身对照溶液已连续进样6次，峰面积rsd不大于2%，留存时间rsd不大于1%。
（2）专属性专属性系指在其它成分可能将并存的情况下，使用的方法能够精确测量出来被测杂质的特性。
对于原料药，可以根据其制备工艺，使用各步反应的中间体（尤其就是后3步反应的中间体）、非对映异构体、特定杂质、粗品等做为测试Fanjeaux展开系统适用性研究，实地考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的拆分度与否符合要求，从而检验分析方法对工艺杂质的拆分能力。
对于制剂，重点掌控水解杂质。
专属性试验（用二极管阵列检测器）1、原料药溶剂自身对照供试品起始原料合成中间体特定杂质（可能会与初始原料和制备中间体重复）混合样：将起始原料、合成中间体、特定杂质加到供试品溶液中。
特定杂质的浓度一般同限度浓度，起始原料和合成中间体的浓度一般同自身对照的浓度（如果浓度过高，可能会有杂质峰干扰）。
以上样品各入一针，主要实地考察色谱条件能够无法有效率验出杂质，以及各个峰之间的拆分情况，特别就是主峰和特定杂质峰与相连杂质峰的拆分情况。
注：在现有标准的色谱条件下，如果有的起始原料和合成中间体的峰与主峰的拆分度不符合要求或者留存时间过长，只要初始原料和制备中间体不是水解产物，可以用其它最合适的色谱条件单独掌控，如果粗品中未验出，以后可以无此掌控。
破坏试验酸、碱、高温、光照、水解、金属离子（Suippes。
通常用铁离子，因为最有可能碰触至）。
为了易于比较，同时进未毁坏的样品。
空白：酸碱空白、氧化空白，处理过程与样品的最终破坏条件相同。
热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。
光照毁坏：如果已经搞过影响因素试验，需用光照10天的图谱替代。
HPLC法测定福多司坦口服液的含量和有关物质
ｉｎｎ），５岬）；流
ｔｏｏｌ・
１０
ｌｎｌ量瓶中，加水稀释至刻度，得储备液②。精密量取储备
动相：乙腈：水（含０．０２５ ｍｏｌ・Ｌ“辛烷磺酸钠和０．Ｏｌ ｎｍ；流速：１．０ ｍｌ：ｍｉｎ～；柱温：室温。
液①ｌ，２，５ ｍｌ置ｌＯ ｍｌ量瓶中，加水稀释到刻度；精密量取 储备液②０．５，１，５ ｍｌ置１０“量瓶中，加水稀释至刻度。量 取不同浓度的对照品溶液２０斗ｌ注入液相色谱仪，按上述色 谱条件测定，以浓度（Ｃ）为横坐标，以峰面积（Ａ）为纵坐标， 进行线性回归，回归方程为Ａ＝５．００５５Ｃ＋７．５３２３（ｒ＝０．９９９
ｍｏｌ・
９，ｎ＝６）。结果表明福多司坦在５．００—５００．１０嵋・ｍｌ“之
间时，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 ２．５精密度试验 精密量取线性项下浓度为１００．０２ ｐ，ｇ・ｍｌ“的对照品溶 液２０一连续进样６次，计算峰面积的ＲＳＤ为０．８７％。 ２．６最低检测限和最低定量限 取对照品溶液，不断稀释并取样检测，按信噪比法得出， 其检测限为４ ｎｇ，定量限为２０ ２．７回收率试验 分别精密称取福多司坦对照品约３２０，４００，４８０ ｎａｇ（各３ 份），置５ ｍｌ量瓶中，按处方量加入辅料，加水溶解并稀释至 刻度，摇匀得溶液①，精密吸取溶液①３ ｍｌ置２５“量瓶中， 加水溶解并稀释至刻度得溶液②。再精密移取溶液②ｌ Ｉｎｌ置
ｍｎ）×４．６
５ １０ １５ Ｄ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｅ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｆ ２０ ２５ ｔ／ｍｉｎ
ｄｂ彳；；千＝；Ｆ；亓；彳
５ １０ １５ ＾ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｂ ２０ ２５ ５ １０ １５ ２０ ２５ ｔ／ｒａｉｎ
Ｃ
Ａ．空白辅料Ｂ．未破坏样品Ｃ．酸破坏 Ｄ．碱破坏Ｅ．氧化破坏Ｆ．高温破坏 圈１ ＨＰＬＣ色谱圈
含量与有关物质分析方法验证可接受标准
耐用性
• 有关物质： 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH
值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化 ±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同 批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化， 每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂 质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分 峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据 （n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量 的绝对值在±0.1％以内。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
准确度
• 有关物质： 验证时一般要求根据有关物质的定量限与 质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓 度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限 度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1 ％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定 其含量，将实测值与理论值比较，计算回 收率，并计算9个回收率数据的RSD。
1.准确度
含量： • 该指标主要是通过回收率来反映。验证时
一般要求分别配制浓度为80％、100％和 120％的供试品溶液各三份，分别测定其含 量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
可接受的标准为：各浓度下的平均回收 率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数 据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
8.系统适用性
• 含量： 配制6份相同浓度的供试品溶液进行分
析，主峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大 于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主 峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
含量及有关物质分析方法验证的可接受标准
有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
6.定量限
含量： 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。 另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份 溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。 另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份 溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%， 峰面积的相对标准差应不大于5.0%。
8.系统适用性
含量： 配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析， 主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主 峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另 外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂 质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应 符合质量标准的规定。
系统适用性
有关物质： 配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析， 该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%， 保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外， 杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数 应符合质量标准的规定。
准确度
有关物质： 验证时一般要求根据有关物质的定量限与质 量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供 试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%， 则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3 ％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值 与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收 率数据的RSD。
线性
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不 得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2 ％以内，响应因子的相对标准差应不大于 2.0%。
线性
有关物质： 在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓 度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积， 计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰 面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：相关系数（R）不得小 于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以 内，响应因子的相对标准差应不大于10%。
HPLC法测定对乙酰氨基酚含量验证方案
按上述色谱条件进样，计算回收率及回收率平均值和相对标准偏差。
结果要求：平均回收率在95.0%-102.0%，RSD≦1.0%。
（五）样品含量测定
取对乙酰氨基酚供试品适量，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液和“对照品溶液的制备”项下制备对照品溶液，按“色谱条件”项下的条件进行进样测定，记录色谱图，按外标法计算含量。
根据《中国药典》二部规定，按干燥品计算，含对乙酰氨基酚应为98.0%-102%。
四、设计小结
高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，在检测的过程中方法简单便于操作，且测定方准确度高，稳定性较好。
本设计方案运用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，HPLC 法专属性强，重现性较好、稳定性较好，准确度和回收率较高，可以作为对乙酰氨基酚片的质量控制方法，用来提高对乙酰氨基酚的质量标准。
利用甲醇-水溶液的配比作为流动相进行检测，再利用试液进样前应用0.22μm微孔滤膜过滤，以除去流动相中的微小杂质，这样可以较大提升试验的准确性。
五、附件材料
图1高效液相色谱仪图2 分析天平
六、参考资料。
HPLC法测定原料药磷酸芦可替尼的含量和有关物质
the flow rate was 1. 0 mL · min -1 , detecting wavelength was 220 nm. The results showed the calibration curve of
色谱柱。
1. 2 试 药
磷酸芦可替尼对照品 (201812001R) 、 杂质对照品 B、 C、
第一作者: 沈红梅(1970-) , 女, 高级工程师, 主要从事药学研究和应用。
D、 E 及三批样品(20190101、 20190102、 20190402) 均由科伦药
供参考。
1 仪器与试药
1. 1 仪 器
Aglient 1260 液 相 色 谱 仪, 二 极 管 阵 列 SPD - 10MAVP
( DAD) 检 测 器 及 Aglient 1260 紫 外 检 测 器, 定 量 进 样 阀,
Aglient 1260 色谱工作站; Inertsil ODS-3 250 L×4. 6 mm, 5 μm
量, 加稀释剂溶解并稀释制成每 1 mL 中约含磷酸芦可替尼及
杂质 B、 C、 D、 E 均为 50 μg 的溶液, 作为线性贮备液; 分别
精密量取该 溶 液 0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 5. 0 置 50 mL 量 瓶 中,
加稀释剂稀释至刻度, 摇匀, 分别取 10 μL 注入液相色谱仪,
1. 18
杂质 B / % 杂质 D / % 总杂质 / %
HPLC测定有关物质和含量方法验证
HPLC测定有关物质和含量方法验证1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4.各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。
1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。
C.试验要求：a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。
B.试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。
具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。
HPLC法测定枸橼酸坦度螺酮片含量和有关物质
HPLC法测定枸橼酸坦度螺酮片含量和有关物质李婧;何黎黎;仇丽颖;李佳川【摘要】采用高效液相色谱法,用Luna C18柱(250 × 4.6mm,10μm),以乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(35:65,pH3.0)为流动相,流速:1ml/min,柱温:25℃,进样量20μL,检测波长:239nm.在该色谱条件下枸橼酸坦度螺酮和杂质峰达到良好分离(R＞1.5),枸橼酸坦度螺酮在1.0～200.0μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9991);重复性及精密度良好(RSD＜2％),3种浓度的平均回收率分别为100.17％、99.03％及99.75％(n=3).方法快速、简便、准确,适用于枸橼酸坦度螺酮片的含量测定和有关物质检查.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(042)002【总页数】5页(P183-187)【关键词】高效液相色谱法;枸橼酸坦度螺酮;含量测定【作者】李婧;何黎黎;仇丽颖;李佳川【作者单位】西南民族大学,四川成都610041;西南民族大学,四川成都610041;西南民族大学,四川成都610041;西南民族大学,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】O657.7;R917随着生活节奏的加快，焦虑的发生率日益增加.新一代抗焦虑药枸橼酸坦度螺酮(图1)属于氮杂螺酮(azapirone)类药物，是一种5-HT受体激动剂，通过激动5-HT1A的自身受体，从而调节中缝核投射到海马区的5-HT，进而抑制行动抑制系统中的5-HT效应，发挥抗焦虑作用[1-3].本品由日本住友制药株式会社研制，1996年首次于日本上市.坦度螺酮适应范围较广，对恐怖、抑郁、焦虑、烦躁和睡眠障碍等精神症状有效[4-8].坦度螺酮不良反应少，安全性高，适宜长期使用.但对于心功能、肝肾功能、呼吸功能不全及器质性脑功能障碍者慎用[9-13].目前国外对坦度螺酮含量测定及有关物质有一定研究，但报道较少，实验条件苛刻，本研究建立了高效液相色谱法测定坦度螺酮片，该法简便、准确，适用于坦度螺酮片的质量控制.1.1 仪器日本岛津LC-10ATvp型高效液相色谱仪;色谱柱为Luna C18柱(250×4.6mm，10μm);Milli-Q Academic超纯水仪，赛多利斯BS224S万分之一电子天平.1.2 材料枸橼酸坦度螺酮普通片(规格:10mg，批号: 150912)由四川大学华西药学院药剂教研室研制.乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，实验用水为重蒸馏水，其余试剂均采用分析纯.2.1 色谱条件与系统适用性色谱柱采用Luna C18柱(250×4.6mm，10μm);流速:1ml/ min，柱温:30℃;进样量20μL.流动相:乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(35:65，调PH至3.0)，检测波长:239nm.理论塔板数按照枸橼酸坦度螺酮峰计算应不低于5000，枸橼酸坦度螺酮峰与相邻杂质峰分离度应不低于1.5.2.2 含量测定2.2.1 溶液的配制对照品溶液配制:取枸橼酸坦度螺酮标准对照品适量，加流动相溶解，制成每1ml 含枸橼酸坦度螺酮10μg的溶液，作为对照品溶液.供试品溶液配制:取本品10片，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮1mg的细粉适量，置于100ml容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液.2.2.2 含量测定取对照品及供试品溶液各20μl进样，记录色谱峰面积，按照外标法计算供试品枸橼酸坦度螺酮的含量.2.3 方法验证2.3.1 分析方法专属性试验对空白辅料溶液、照品溶液及供试品溶液进行考察，HPLC色谱图见图2.结果表明流动相及空白辅料不干扰枸橼酸坦度螺酮的测定.2.3.2 精密度试验在“2.1”项的色谱条件下，在同日内对同一样品测定6次，枸橼酸坦度螺酮的日内RSD为0.38%，表明精密度良好.2.3.3 重复性试验分别取三批样品，于“2.1”项的色谱条件下，在不同日期进行含量测定，枸橼酸坦度螺酮的日间RSD分别为0.78%、0.59%、0.92%，表明重复性良好.2.3.4 溶液稳定性试验室温(25℃)条件下，取“2.2.1”项下供试品溶液溶液放置0、1、4、10、20小时，在“2.1”项的色谱条件下测定，结果枸橼酸坦度螺酮片含量的RSD为0.86%.结果表明样品溶液在室温(25℃)条件下20小时内稳定.2.3.5 线性关系检测限及定量限取枸橼酸坦度螺酮对照品，分别制成浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200μg·ml-1的溶液，分别进样20μl，记录峰面积.以枸橼酸坦度螺酮峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程为: y =29827x - 5213.6(r=0.9991)，表明枸橼酸坦度螺酮浓度与峰面积在1.0～200.0μg·ml-1范围内线性关系良好.取枸橼酸坦度螺酮原料药用流动相稀释成不同浓度溶液.测定主峰峰高及相同条件下的色谱基线噪声，以信噪比3:1作为检测限，以信噪比10:1作为定量限.枸橼酸坦度螺酮检测限为0.60 ng，定量限为1.85 ng.2.3.6 回收率试验精密称取枸橼酸坦度螺酮对照品按处方比例加入辅料，用流动相制成低、中、高三种浓度溶液(8.0、10.0和12.0μg·ml-1)，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按照外标法计算，平均回收率分别为100.17%、99.03%及99.75%，RSD分别为2.01%、1.82%及1.36%(n =3).2.4 含量测定结果取3批样品，照“2.2.1”色谱条件及“2.2.2”项下方法进行测定，记录峰面积，按外标法计算含量.含量测定结果见表1.2.5 有关物质检查2.5.1 有关物质测定法取本品10片，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置于100ml容量瓶中，用流动相稀释溶解至刻度，滤过后取续滤液，作为供试品溶液;精密量取上述供试品溶液1ml，于100ml容量瓶加流动相稀释100倍，作为对照溶液.取供试品溶液，进样20μl，色谱图时间保留至主峰出峰的2倍时间;另取对照溶液进样20μl，检测灵敏度调节至主峰峰高约为满量程的10-20%.记录供试品溶液HPLC色谱图中各杂质峰面积，杂质峰面积之和不得大于对照液主峰面积的1倍(1%).单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5%).2.5.2 强制降解试验氧化试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加过氧化氢溶液10 mL，室温放置1小时后，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3 (A).碱解试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加10ml 0.1mol·ml-1氢氧化钠放置2 h，用盐酸中和至中性，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(B).酸解试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加10 ml 0.1mol·ml-1盐酸放置2小时，用氢氧化钠中和至中性，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(C).高湿试验:取样品10片，RH90%的湿度下放置10天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(D).高温试验:取样品10片，在60(C时加热10天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(E).强光试验:取样品10片，在强光(照射度为4500 ±500LX)下，照射3天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(F).按照“2.5.1”项下方法试验.试验结果表明，本品对氧化、酸、碱较为敏感.图谱显示，各降解试验产生的杂质均能与主成分产生较好分离(分离度大于1.5).说明本研究所建方法专属性较强.2.5.3 重复性试验按“2.5.1”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，以杂质含量进行方法的精密度考察，结果总杂质RSD为0.86%，最大单一杂质RSD为1.23%，表明本方法重复性较好.2.5.4 有关物质测定结果按照2.5.1项下方法，分别对三批样品有关物质进行检查，检测结果见表1.资料研究表明枸橼酸坦度螺酮片虽然安全性较好，但对过敏及肝肾功能不全者慎用[14 -15]，所以应对合成过程中产生的有关物质进行控制.由稳定性试验和破坏性试验可知，在氧化、酸及碱性条件下杂质会增多，根据枸橼酸坦度螺酮的生产工艺情况，本研究限定了本产品的最大单一杂质及杂质总量.对本品降解产物的研究还需进一步研究，以更好控制本品的质量.波长选择中用甲醇降枸橼酸坦度螺酮对照品溶解制成10μg.ml-1的溶液，进行紫外扫描(200～400nm).结果枸橼酸坦度螺酮在波长239nm处有最大吸收值，在该波长处空白辅料流动相溶液不干扰样品的测定，所以采用239nm为测定波长.中国药典2015年版未收载枸橼酸坦度螺酮质量标准，本研究可以为坦度螺酮的质量控制提供参考.【相关文献】[1]村崎光邦.Tandospirone的基础临床[J].临床精神药理，1998，1 (1):81-92 .[2]SHIMIZU H，KARIAI N，HIROSE A，et al.Interact ion of SM-3997 with serotonin receptors in rat brain[J].Japanese Journal of Pharmacology，1998，46(2):311-314 .[3]SHOMIZU H，TATSUNO T，TANAKA H，et al.Serotonergic mechanism in anxiolytic effect of tandospirone in the vogel conflict test[J].Japanese Journal of Pharmacology，1992，59(3):105-112 .[4]YAMADA K，YAGI G，KANBA S.Clinical efficacy of tandospirone augmentataion in patients major depressive disorder:a randomized controlled trial[J].Psychiatry and Clinical Neurosciences，2003，57(2): 183-187.[5]YAMAUCHI K，YAMADA S，MORITA K，et parative study of short-term anxiolytic potency of alprazolam and tandospirone in psychiatric outpatients with anxiety disorders[J].Human Psychopharmacology-clinical and Experimental，2001，16(6):469-473.[6]KANEDA Y，FUJII A.Effects of tandospirone，a serotonin -1A agonist， on the Hypothalamo-Pituitary-Gonadal axis of male patients[J].Neuroendocrinology Letters，2001，22(4):243-247.[7]OSHIMA T，KASUYA Y，TERAZAWA E，et al.The anxiolytic effects of the 5-hydroxyptamine-1A agonist tandospirone before otolaryngologic surgery[J].Anesthesia and Analgesia，2001，93(5):1214-1216.[8]SHIMIZU H，KARIAI N，HIROSE A，et al.Interaction of SM-3997 with serotonin receptors in rat bain[J].Japanese Journal of Pharmacology，1998，46:311-314.[9]SASA M.A new approach to innovating selective anxiotyties phanmtcological profile ofa novel 5-HTIA agonist tandospirone[J].Journal of Clinical Psychopharmacology，1997，17:272-277.[10]李乐华，陈晋东，陈晓刚，等.坦度螺酮治疗广泛性焦虑症的疗效和安全性:随机、双盲、对照研究[J].中国临床康复，2004，8(21): 4176 -4178.[11]陶用富，赵智慧，周豪，等.坦度螺酮与氯硝西泮治疗广泛性焦虑症的对照研究[J].精神医学杂志，2008，21(1):27-28.[12]SUMIYOSHI T，YASUND F.Serotonin1A receptors in memory Function[J].American Journal of Psychiatry，2004，161:1505-1506.[13]陈朝元，何顺勇.顽固性功能性消化不良与情绪障碍的关系及坦度螺酮的治疗作用[J].世界华人消化杂志，2006，14(16):1635-1637.[14]村崎光邦，森温理，远藤俊吉.各种神经症に对する新规向精神药Tandospirone(SM-1997)の临床评价[J].Journal of Evaluation in Clinical Practice，1992，26:295-329 .[15]木村政咨，中川哲也，玉井一，美根和典，立花俊郎.新规向精神药Tandospirone(SM-3997)の临床评价[J].新药と临床，1992，46 : 565-574 .。
含量及有关物质分析方法验证的可接受标准
溶出介质体积的选择
漏槽条件即做溶出的最佳条件，是指药物 所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理 学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外 包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的， 满足药物溶解-吸收的过程，漏槽条件起到了 修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶 液所需介质体积的3～5倍。
（3）转篮法与桨法的选择
含量及有关物质 分析方法验证的可接受标准
文章来源：药审中心 审评二部 黄晓龙
本文介绍了在对含量及有关物质测定所用的 分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接 受标准，以利于判断该分析方法的可行性。
内容包括：准确度、线性、精密度、专属性、 检测限、定量限、耐用性和系统适应性 。
1.准确度
含量： 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般 要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供 试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值 与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均 应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相 对标准差（RSD）应不大于2.0%。
3.精密度
含量： 1）重复性 配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析 人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供 试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度 配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个 分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得 12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。
化学药品溶出度方法研究
文章来源：审评二部 唐素芳
化学药品普通口服固体制剂 溶出度方法验证易忽视的几个问题
文章来源：审评四部审评八室 郑国钢
溶出度研究试验主要包括以下内容：
（1）溶出介质的选择 （2）溶出介质体积的选择 （3）溶出方法（转篮法与桨法）的选择 （4）转速的选择 （5）溶出度测定方法的验证 （6）溶出度均一性试验（批内） （7）重现性试验（批间）
HPLC测定有关物质和含量方法验证小结
HPLC测定有关物质和含量方法验证小结HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析技术，广泛用于药物分析、食品检测、环境监测等领域。
在HPLC分析中，方法验证是确保测定结果可靠和准确的重要步骤。
本文将主要介绍HPLC测定有关物质和含量方法验证的步骤和要点。
1.确定准备验证的物质和含量：首先需要确定待验证方法测定的有关物质和其含量范围。
这可以通过药物活性成分或其他关键组分在药物产品或样品中的分析来确定。
2.建立验证实验设计：验证实验应该具有统计学意义，包括相应的标准溶液的准备和分析方法的详细描述。
一般情况下，验证实验应包括至少3次测定，以评估方法的精密度和准确度。
3.确定方法参数：在验证实验中，需要确定方法的准确度、精密度、线性范围、检测限、定量限、选择性、重复性等参数。
这些参数的确定通常需要通过分析一系列标准溶液来完成。
4.评估方法的准确度：准确度是指测定值与真实值之间的接近程度。
评估方法准确度常采用回收率试验，即在已知含量的待测样品中加入已知量的标准物质，然后测定其回收百分比。
一般要求方法的准确度在80%~120%之间。
5.评估方法的精密度：精密度是指在相同条件下，同一样品重复测定的结果之间的接近程度。
精密度常采用测定重复样品的相对标准偏差（RSD）来评估，一般要求精密度不超过2%。
6.评估方法的线性范围：线性范围是指样品中的含量与峰面积之间的关系。
通常通过测定一系列浓度递增的标准溶液来评估方法的线性范围。
一般要求线性相关系数（R2）大于0.9997.评估方法的选择性：选择性是指分析方法对有关物质的测定是否受其他组分的干扰。
一般通过重复测定混合样品和单配制品进行评估。
8.评估方法的重复性：重复性是指在较短时间内在相同实验条件下测定同一样品进行的重复试验结果之间的接近程度。
重复性常采用相对标准偏差（RSD）来评估。
在HPLC测定有关物质和含量的方法验证过程中1.校准和标定：必须准确校准仪器并建立标准系统，以确保所得到的结果为准确结果。
含量和有关物质方法学验证
含量和有关物质方法学验证（HPLC法）系统适用性试验的配制方法：在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。
介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。
（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。
选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。
如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。
最小峰面积的设定●其设定，不是绝对值，而是相对值。
●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。
普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。
如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。
新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。
●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。
检测限（将被测物溶液不断稀释后进样测定，直至被测物峰面积无法检出为止，此时的浓度即为最低检出浓度）：●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。
●是相对值，不是绝对值。
是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。
供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。
同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。
表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10μl，规定杂质限度1.0％)。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结一、样品测定1、流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2、样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3、记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4、进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC 系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5、计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6、仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0、1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0、5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0、1~0、3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
检测HPLC验证报告
检测HPLC验证报告HPLC验证报告的目的是对高效液相色谱（HPLC）方法进行验证，并确保其在实验室环境中的准确性和可靠性。
这是一项非常重要的工作，因为合理和准确的验证结果对于实验室的品质控制和分析结果的可信度至关重要。
HPLC验证报告以实验室测试的数据为基础，结合HPLC方法的验证原理和标准要求，对该方法进行全面分析和评估。
验证报告应包含详细的验证计划、实验流程、验证参数、数据分析和结论等内容。
该报告的目的是确保HPLC方法的可靠性、准确性和一致性。
通过验证报告，我们可以评估该方法是否能够在特定条件下有效分离和定量分析化合物。
因此，了解HPLC验证报告的目的和重要性对于实验室的质量管理和实验结果的可靠性至关重要。
本报告将解释HPLC验证报告的具体步骤和方法，包括样品制备、仪器设置和分析条件等。
样品制备在进行HPLC验证之前，首先需要准备样品。
样品制备的步骤如下：确定需要分析的目标物质，例如药物或化合物。
按照标准操作程序，准备样品溶液。
确保使用纯净的溶剂和标准品（如果适用）。
对于固体样品，将其适当加工或粉碎，以便于溶解。
按照实验要求和标准程序，对样品进行必要的稀释或浓缩。
仪器设置在进行HPLC验证之前，需要进行仪器设置。
仪器设置的步骤如下：打开HPLC仪器，并确保其正常工作，例如检查移液器、柱和检测器。
清洗和平衡柱，以确保柱得到适当的运行条件。
设置所需的流动相，包括溶剂和缓冲液。
确保溶剂和缓冲液的配制符合设备要求。
设置流速、温度和压力等操作参数，以确保稳定的运行条件。
分析条件在进行HPLC验证之前，需要设置适当的分析条件。
分析条件的步骤如下：确定所需的检测波长和峰检测方式，例如紫外检测或荧光检测。
对于每个目标物质，根据其化学特性和前期实验结果，设置适当的保留时间窗口和峰宽度。
根据样品的特性，设置适当的进样量和进样方式。
建立质量标准曲线，并确定目标物质的检测限和定量范围。
在进行HPLC验证时，需要注意以下事项：检测过程中应严格遵守实验室安全规范和操作规程。
HPLC测定有关物质和含量方法验证小结
本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法,试验要求本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论方法开发的内容不在本帖讨论范围内1．有关物质（适用于API,制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件:1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察.3.在检测波长下,选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4。
各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6。
供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1。
1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。
1.1.2试验方法1.1。
2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0。
1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。
C。
试验要求:a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1。
5;杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中,已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5);各已知杂质之间的分离度应大于1.5(至少1.2)；1。
1。
2.2强制降解试验A。
目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证.B。
试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定.具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析,保证实验的意义即可。
含量和有关物质方法学验证内容
含量和有关物质方法学验证内容(总2页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除含量测定方法学验证内容及可接受标准：1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。
验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在%%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于%。
2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。
具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。
以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于%。
3．精密度 1）重复性配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于%。
2）中间精密度配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于%。
4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于。
以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。
5．检测限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
6．定量限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。
另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于%。
7．耐用性分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。
可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于%。
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本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法，试验要求本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论方法开发的内容不在本帖讨论范围内1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4.各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。
1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。
C.试验要求：a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。
B.试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。
具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。
试验一般的范围为：强酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或视情况调节时间，温度，体积强碱：0.1~5.0mol/L NaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积强氧化剂：30%的H2O2或视情况配制不同浓度的溶液或视情况调节时间，温度高温：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验光照：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验C.试验要求a.一般样品含量控制在85%—90%范围（归一化法），不一定要求每个条件都能降解出来。
b.在进行酸、碱、强氧化破坏试验时，每个试验最好都要做相应的空白（溶剂，空白辅料，复方制剂还包括除去某一主药的其他组分）破坏试验作为辅助。
c.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0（至少1.5），已知杂质与相邻杂质分离度大于1.2d.物料守恒，即未破坏主药的C/A与破坏后的C/A值相比，结果在0.9~1.1之间e.关于破坏试验，更多内容请参阅lyslinjiu版主在帖子【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）2013-专属性实验（强制降解试验）- 丁香园论坛f.在此处做梯度时间（如有）延长验证试验。
即将分析方法的梯度中，有机相比例最大的时长延长（建议延长时间为主峰保留时间或10~20min），考察是否降解出难以洗脱的物质在拟定方法的梯度周期内能有效检出。
进一步考察分析方法的合理性1.2定量限1.2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。
1.2.2验证方法A.目的考察杂质的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。
C.试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/51.3检测限1.3.1概念样品中能被检测出的最低量，仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。
1.3.2验证方法A.目的考察杂质的最低检出量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为3时，得检测限。
C.试验要求检测限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/101.4溶液稳定性1.4.1目的考察被测各溶液在特定时间周期内的稳定性1.4.2试验方法a.配制系统适应性溶液、供试品溶液、对照品溶液，在室温条件下，分别在各时间点进样b.如不稳定，需考察在低温条件下的溶液稳定性c.时间范围根据试验需要来确定。
比如做回收率中需要至少连续测定9份供试品，是所有单个验证项目中最长的，选择这个时间点是可以的。
也有考虑到以后需要测定更多的样品，选择更长的时间范围。
1.4.3试验要求a.系统适应性溶液，各峰之间分离度应符合要求。
b.对照品溶液峰面积RSD应小于2.0%c.供试品溶液，杂质个数和杂质量应一致，峰面积RSD应小于5.0%；不得检出新增杂质d.如不稳定，需临用现配或低温保存1.5仪器精密度1.5.1概念同一溶液，连续进样6次，其tR和峰面积的精密度，考察仪器的进样精密度1.5.2试验方法配制限度浓度的各杂质和主成分的混合溶液，连续进样6次1.5.3试验要求a.tR的RSD小于2.0%b.各峰面积RSD小于2.0%1.6线性与校正因子1.6.1概念在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系1.6.2试验方法配制各杂质和主成分的混合溶液，逐步稀释，浓度范围从定量限至限度浓度的120%以上，至少配制5份以上溶液。
由2人分别进行。
1.6..3试验要求a. 线性关系系数r大于0.990b.Y轴截距应在100％响应值的25％以内c. 响应因子的相对标准差应不大于10%d.2人测得斜率之比在0.98~1.02之间e.计算出来的校正因子应进行修约，在0.9~1.1范围内的，修约为1.0进行计算；0.2~5.0范围内的，按校正因子计算；0.2~5.0范围外的，按外标法计算。
1.7精密度1.7.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。
1.7.2重复性1.7.2.1试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。
1.7.2.2试验要求a.检出杂质个数，杂质相对保留时间，各杂质百分含量均应一致b.单个杂质的百分含量的极差应在其含量±10%以内c.杂质总量的RSD应小于5.0%1.7.3中间精密度1.7.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。
1.7.3.2试验要求a.同1.7.2.2-a和bb.单个杂质和杂质总量的RSD应小于10.0%1.8回收率1.8.1概念用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。
1.8.2试验方法a.配制各杂质的混合贮备液b.称取供试品适量，精密加入混合杂质贮备液适量，配制成溶液，使供试品浓度为测定浓度，杂质浓度分别为限度浓度的50%，100%，150%。
各浓度均平行配制3份c.配制混合杂质对照品溶液和自身对照溶液1.8.3试验要求a.各浓度下的回收率应在90%~110%之间b.回收率（N=9）的RSD应小于10.0%c.用加校正因子的自身对照法计算结果应与杂质外标法计算结果一致1.9耐用性1.9.1概念在拟定的分析方法有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的分析方法用于常规检测提供依据1.9.2试验方法a.分析方法中可变动的因素有：流动相组成比例，水相pH，柱温，色谱柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色谱柱），流速，检测波长b.配制系统适应性溶液，供试品溶液，对照品溶液进行测定1.9.3试验要求a.系统适应性溶液应符合规定；如不符合规定，则需更严格控制所变化的因素，直至找到一个合适的范围；如指定色谱柱，严格控制pH等等b.检测杂质个数，杂质的相对保留时间应与精密度结果一致c.测得杂质量应与精密度结果一致2．含量测定（适用于API，制剂，也适用于单个杂质控制）含量测定方法验证的前提条件：1.空白（溶剂和辅料）和各杂质不干扰主峰的测定2.根据主成分的紫外吸收波长（复方需分别单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，计算S/N，预估主成分浓度4.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明2.1专属性：2.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定主成分的能力。
2.1.2试验方法2.1.2.1定位试验：A. 目的同1.1.2.1-AB.试验方法同1.1.2.1-BC.试验要求：a．空白应和各杂质不得干扰主成分的测定，主峰保留时间处不得为梯度峰拐点（如有）b．定位溶液中，主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.02.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对含量测定分析方法用于检查主成分的专属性进行验证。
B.试验方法同1.1.2.2-BC.试验要求a.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0其他同1.1.2.2-C2.2定量限2.2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。
2.3.2验证方法A.目的考察主成分的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制检测浓度的主成分溶液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。
C.试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于检测浓度的1/102.3溶液稳定性试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%如溶出检测方法同含量，建议考察一个溶出曲线周期内的溶液稳定性其他同1.4项下2.4仪器精密度试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%其他同1.5项下2.5线性与校正因子2.5.1概念在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系2.5.2试验方法配制主成分贮备液，逐步稀释，浓度范围从检测浓度80%至120%，至少配制5份以上溶液。
由2人分别进行。
2.5.3试验要求同1.6.32.6精密度2.6.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。
2.6.2重复性2.6.2.1试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。
2.6.2.2试验要求6份供试品含量结果RSD应小于2.0%2.6.3中间精密度2.6.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。