第三代测序技术及其应用_张得芳
第三代测序技术
第三代测序
◦ 另一类非Sanger 原理的DNA 测序技 术在 2008 年成为现实，这类基于单 个分子信号检测的 DNA 测序被称为 单分子测序 (single molecule sequencing, SMS) ，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS) 。 据预测， SMS 将比 NGS 具有更快的 速度和更低的成本，从而使研究人 员能够实现目前无法进行的研究工 作。尽管从现在的进展来看， SMS 还未能完全实现预期目标，但已经 做出了许多重要的努力。这些新技 术包括 Helicos 的 tSMS ， PacBio 的 SMRT， Oxford 的 Nanopore 以及其 它一些尚处于实验室阶段的技术， 如电镜测序，蛋白质晶体管测序等 等。
dna测序时不需要经过pcr扩增实现了对每一条dna分子的单独测一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现二二第三代测序技术原理第三代测序技术原理三三第三代测序技术特点第三代测序技术特点四四三代测序技术的比较三代测序技术的比较五五第三代测序技术的应用第三代测序技术的应用第四代测序技术第四代测序技术一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现自从2006年第一台454gsflx测序平台上市以来基于非sanger测序原理的第二代高通量测序nextgenerationsequencingngs技术迅速成为了基因组学研究的重要工具其中包括illuminasolexaabisolidroche454以及lifetech的半导体测序仪iontorrentpgmproton
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固态纳米孔测序法
虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳 米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固 体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术 一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物， 而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单 个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无 法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如 氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨 烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是 所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的 检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的 直径为5 - 10纳米。
质谱测序 第三代测序
第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
DNA测序技术的进展及应用
DNA测序技术的进展及应用DNA测序技术是基因组学领域中关键的技术之一，具有广泛的应用场景。
随着技术的不断进步，越来越多的应用场景被揭示出来。
本文将介绍DNA测序技术的进展和应用。
一、DNA测序技术的进展DNA测序技术首次被开发于1977年，但当时的技术限制了测序长度和准确性。
随着技术的发展和成本的降低，测序技术已经被广泛应用于各种领域。
1.第一代测序技术第一代测序技术基于Sanger测序方法，通过DNA聚合酶链反应和荧光染料标记的阴离子交换色谱分离技术，可以对较短的DNA序列进行测序。
该技术的受限于测序长度、掩模效应和成本，但是该技术对DNA序列的研究做出了重要的贡献。
2.第二代测序技术第二代测序技术基于高通量测序平台，其通过同步测量大量的核酸序列，可以对长达数百万个核酸片段进行测序。
这些片段会被并行地进行测序，从而大大提高了测序效率和准确性。
同时，该技术还一定程度上缓解了第一代技术的限制。
3.第三代测序技术第三代测序技术基于单分子测序平台，该平台可以实现长DNA序列的直接读取，大大提高了测序的准确性，消除了掩模效应和信号叠加的问题。
与此同时，该平台还大大降低了测序的时间和成本，为研究人员提供了新的研究手段和解决方案。
二、DNA测序技术的应用1.基因组辅助育种DNA测序技术可以快速、准确地鉴定和筛选一些具有重要经济价值的性状，如多种疾病的遗传模式、抗病性、产量性状等。
该技术可以通过检测育种动物的SNP序列，提高育种效率和质量，促进现代农业可持续发展。
2.个性化医疗DNA测序技术可以通过检测个体基因组序列的突变，提供个性化的医疗解决方案。
临床医生可以基于患者的个体基因组序列信息，制定个性化的治疗方案，提高治疗效果和预后。
3.生态环境监测DNA测序技术可以通过检测环境中的微生物和植物DNA序列，揭示生态系统的结构和功能，并评估环境的质量状况。
该技术可以用于监测自然生态系统，评估生态系统的健康状况，对环境污染及时响应和治理。
DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用
DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用DNA测序技术是指对DNA分子进行核苷酸序列的测定和分析的技术。
随着科技的不断进步，DNA测序技术也不断更新，目前，第三代测序技术已经成为主流，而第四代测序技术正在快速发展。
本文主要介绍DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用。
一、第一代DNA测序技术第一代DNA测序技术是指使用Sanger测序技术对DNA进行测序。
Sanger测序技术是以DNA聚合酶为基础，通过富集、扩增、定点位点标记技术，从而进行DNA测序。
Sanger测序技术不仅能够快速、准确地测序DNA，还可以在生命科学研究中应用于各种领域，比如基因表达分析、单核苷酸多态性研究等，因此在生命科学研究中被广泛应用。
二、第二代DNA测序技术第二代测序技术在Sanger测序技术基础上进行了改进，通过构建并行测序平台，实现了大规模的高通量测序。
目前比较常用的第二代测序技术有Illumina、ABI SOLiD和Roche 454等。
相比于第一代测序技术，第二代测序技术明显提高了测序速度和检测效率，而且测序成本也大幅降低，因此被广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等多个生命科学领域。
三、第三代DNA测序技术第三代测序技术采用的是单分子测序技术，其代表性产品是Pacific Biosciences（PacBio）公司的PacBio RS II系统和OXFORD Nanopore公司的MinION系统。
这些技术可以直接对DNA分子进行测序，不需要像第二代测序技术那样通过PCR扩增，因此可以实现测序的实时跟踪和单分子检测。
第三代测序技术具有高精度、低重复性、长读长优势，另外，它还支持直接检测了草图、异质体、基因重复、基因捆绑、病毒等长读长的表达，可以更精确地对以上问题进行分析。
因此，在如基因编辑和癌症诊断、药物筛选和婴儿基因疾病检测等方面有自己的应用。
四、DNA测序在生命科学中的应用1. 基因组研究DNA测序技术在基因组研究中有着非常重要的应用。
第三代测序技术的原理和应用
第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。
第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。
为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。
本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。
第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。
第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。
2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。
这大大提高了测序速度，并降低了成本。
3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。
这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。
第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。
以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。
2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。
3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。
4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。
5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。
第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。
第三代测序技术及其在高通量基因测序中的应用
第三代测序技术及其在高通量基因测序中的应用DNA是生物体内最基本的分子，记录着生命的遗传信息。
对DNA的研究非常重要，它不仅能够揭示生命的本质，还有助于人类治疗疾病和提高农业生产力。
成功完成人类基因组计划后，测序技术得到了迅速发展。
第一代测序技术是Sanger测序，使用dideoxynucleotides作为终止剂，对不同长度的DNA分子进行排序和比对，从而得到DNA序列。
这种技术简单但低效，只能测定短的DNA序列，时间和费用成本也很高，所以难以在实践中广泛应用。
为了能快速、准确地测序DNA，第二代测序技术应运而生。
第二代测序技术通过克服Sanger测序的弊端，在时间、费用成本和测序深度等方面得到了显著的提高。
它的基本原理是利用大量并行化的过程，将DNA分子分割为短片段，然后同时对这些短片段进行测序，最终重建全部DNA序列。
Illumina技术是目前使用最为广泛的一种。
然而，第二代测序技术仍存在几个问题。
首先，由于测序过程中需要将DNA分子分割为短片段，无法充分保持DNA的完整性，因此在研究特定区域的DNA序列时存在误差。
其次，它不能探测DNA序列中的一些变异，如插入或删除区域，因此在分析基因组结构和组织的变异时存在限制。
这些限制为应对不同需求提出了新的测序方法和技术发展的方向。
到目前为止，第三代测序技术已经发展起来，并解决了一些第二代测序技术存在的问题。
第三代测序技术以单个分子为单位，采用直接测序方法，克服了第二代测序无法探测某些区域的问题。
而且，第三代测序可以对长序列进行读取，进一步提高了DNA测序的准确性和时间效率。
Pacific Biosciences (PacBio)的第三代测序技术是在实验室和工业界中被广泛采用的技术之一，其基本原理是将单个DNA分子放入观察室中，通过观察DNA分子的细微变化来识别它们的碱基顺序。
这种技术正在被广泛用于评估个体的表观基因组，并研究癌症、疾病的基因变异和耐药性等。
第三代DNA测序技术的原理及应用
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
第三代基因测序技术的开发和应用
第三代基因测序技术的开发和应用随着科学技术的不断发展，基因测序也发生了很大的变化。
第一代基因测序技术是基于手动方法的，需要大量时间和人力完成，效率很低。
第二代基因测序技术的问世，极大地促进了生物医学领域的研究和发展。
然而，第三代基因测序技术的开发和应用，将会为我们的医疗技术和生物技术带来更为革命性的变化。
第三代基因测序技术是什么？第三代基因测序技术是一种全新的DNA测序技术，它与前两代的技术不同，可以说是一个飞跃。
与前两代相比，第三代基因测序技术具有更快的测序速度，更高的准确性，以及更低的成本。
这一技术的最大优点是可以获得更长的连续序列，比前两代技术获得的序列长得多。
第三代基因测序技术的开发第三代基因测序技术的开发历时几十年。
2005年，比利时的Pacific Biosciences公司发表了第一篇关于单分子实时测序的论文，标志着第三代测序技术的诞生。
该公司于2011年推出了自己的产品PacBio RS，这是市场上首个商业化的第三代基因测序仪器。
2012年，Oxford Nanopore Technologies公司推出了MinION这一开创性的超长读取基因测序仪，真正实现了第三代基因测序技术的商业化。
第三代基因测序技术的应用第三代基因测序技术的应用非常广泛，可以推动各个领域的研究和发展。
例如：1.医疗领域：第三代基因测序技术对医疗领域有着深远的影响，可以应用于基因诊断、疾病预防和治疗等方面，例如癌症基因测序、遗传性疾病基因诊断等。
同时，它还可以为定制化医疗提供技术支持，开创了个性化医疗的新时代。
2.农业领域：第三代基因测序技术可以用于植物和动物的基因组分析和注释，研究杂交种的产生和进化规律等。
此外，它还可以为农业生产提供技术支持，例如肉牛的繁殖规划、豆科作物种质资源维护等。
3.环境领域：第三代基因测序技术可以用于环境样品的DNA分析，研究微生物和真菌群落结构和功能等，对环境微生物的种类和数量进行监测和评估等。
第三代测序技术介绍
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
第三代基因测序技术及其应用前景
第三代基因测序技术及其应用前景随着科技的不断进步，对基因的研究和理解也越来越深入。
基因测序技术的发展，为人类认识基因、探索基因，理解生命的本质带来了无限的可能。
而基因测序技术的第三代，更是为基因研究和医学领域带来了革命性变革。
一、何为第三代基因测序技术？第三代基因测序技术是相对于第一代和第二代基因测序技术而言的。
第一代基因测序技术需要通过PCR扩增后，以克隆和Sanger测序方法进行分析，过程复杂、耗时长、费用高，仅适用于小规模的基因测序。
第二代基因测序技术则是一种更加快速、准确且高通量的测序技术，能够在较短的时间内完成百万级别的基因测序，但是其仍然存在局限性，比如只能识别短序列，无法对基因重组、基因缺失、基因聚合等大分子结构进行测序。
而第三代基因测序技术，利用了微纳米技术，实现了单分子测序，不需要进行克隆，能够直接对DNA、RNA进行高通量测序，大大缩短了测序时间，降低了成本，且能够解决第二代技术无法解决的问题。
二、第三代基因测序技术的应用领域1. 生物学领域第三代基因测序技术的应用可以大大拓展生物学领域的研究范围，提升其研究深度和广度。
基于第三代测序技术，我们可以更加全面地研究细胞、组织、器官、物种之间的分子层次上的差异和特性，快速识别和分析基因、基因组、生命链，探索生命的本质和机制。
2. 医学领域第三代基因测序技术在医学领域中的应用也得到了大量探索和研究。
它可以帮助研究人类遗传上的疾病，发现与基因异常的相关性，为个性化诊疗和治疗方案提供依据。
相比于传统的病理诊断和药物研发方法，第三代基因测序技术在提高准确性、缩短研究时间、增强研究深度和广度等方面具有显著优势，将为医学科学带来全新的革命性变革。
3. 生命科学领域第三代基因测序技术的发展也为生命科学领域带来了更多的广阔空间。
通过第三代基因测序技术，可以实现对生命链的全面认知和分析，不仅仅可以对生命链进行快速测序，更可以读取和理解基因之间的相互关系，探索其生命本质，有助于开发新型生物科技和生物制品。
第三代基因测序原理及应用
发展前景展望
提高准确性
随着技术的不断发展和优化，未来第三代测序技术的准确性将得到 进一步提高，有望接近甚至超过传统测序技术。
降低成本
随着技术的普及和规模化应用，第三代测序技术的成本有望进一步 降低，使得更多人能够享受到高精度基因组测序服务。
拓展应用领域
随着第三代测序技术的不断发展和完善，其应用领域也将不断拓展 ，包括复杂疾病研究、精准医疗、生物多样性保护等。
缺点
测序准确度相对较低，且对DNA样 品的质量要求较高。
链接测序技术
原理
通过连接反应将DNA片段连接成 更长的序列，然后对连接产物进 行测序。连接反应具有高度的特 异性，可以准确识别碱基序列。
优点
测序准确度高、读长较长、适用 于复杂样本的测序。
缺点
测序速度相对较慢，且连接反应 可能受到多种因素的影响，如温 度、pH值等。
挑战与问题
高错误率
第三代测序技术的错误率相 对较高，尤其是在连续测序 过程中，错误率可能会逐渐 累积，影响测序结果的准确
性。
数据处理难度
由于第三代测序技术产生的 数据量巨大，对数据处理和 分析的要求也相应提高，需 要更强大的计算能力和更高
效的算法支持。
成本问题
目前第三代测序技术的成本 仍然较高，限制了其在大规 模基因组测序等领域的应用 。
多维度数据挖掘
利用多组学数据，挖掘基因、环境、生活方式等多因素对人体健康和疾病的影响，为个性化医疗和精准预防提供 科学依据。
智能化和自动化发展方向
自动化样本处理
通和准确性。
智能数据分析
利用人工智能和机器学习技术，对测序数据进行自动分析和 解读，提取有价值的信息和模式，为科研和临床应用提供智 能决策支持。
第三代测序技术单分子即时测序
第三代测序技术单分子即时测序第三代测序技术:单分子即时测序７１８?第三代测序技术：单分子即时测序刘岩吴秉铨ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。
从人类基因组计划（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ测序技术功不可没。
特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进入了高通量、低成本的时代。
目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。
本文回顾了测序技术发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。
一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。
同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。
一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。
在４个ＤＮＡ合成反应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测ＤＮＡ分子的序列。
２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。
但用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。
基因测序技术的创新和应用趋势
基因测序技术的创新和应用趋势基因测序技术是在近年来迅速发展的生物技术领域中，最为热门的话题之一。
它是对个体基因组的深入研究，为医学、生命科学和人类健康等领域带来了无限的可能。
从某种意义上来说，基因测序技术成为了现代医学研究及临床实践中科技与医学的有机融合。
1. 现有的基因测序技术现有的基因测序技术主要有两种：第一代测序技术和第二代测序技术。
第一代测序技术是指由弗雷德里克·桑格等人开发的测序技术，是基因测序技术的开创者。
第一代测序技术采用的是链终止法，能够测序200至1000个碱基对，测序排度慢，成本高。
第二代测序技术是指由罗伊托·哈利芬和约翰逊等人开发的测序技术。
第二代测序技术采用的是并行接合法，测序排度快，成本低，这样能够大规模化地启动测序工作，并取得实际的经济效益。
2. 基因测序技术创新（1）第三代测序技术：第三代测序技术是指对第二代测序技术的全面升级。
这种技术在测序排度和成本控制方面更具优势，且能够产生更多的数据，比如单一DNA单元经过多次测序，可以产生的数据更为丰富。
第三代测序技术涵盖了单分子测序技术、纳米孔测序技术、合成孔测序技术等诸多新技术。
目前，第三代测序技术正在逐步地走向商业化，相信在未来会掀起一股基因测序技术革命的浪潮。
（2）单细胞基因测序：单细胞测序是指对单个细胞进行分析的技术，其应用领域十分广泛，例如病理学、干细胞研究、人类起源研究等等。
单细胞基因测序技术可以避免常规测序中噪声的干扰，发现更为精准和细致的生物学信息，特别适用于研究基因表达的异质性和人类疾病的复杂性。
同时，单细胞测序也在交叉学科学术研究和治疗各方面具有广泛的应用前景。
3. 基因测序技术应用趋势（1）基因编辑技术：基因编辑技术是一种根据基因序列，直接对基因进行改组、删除和替换的技术。
在目前，基因编辑技术主要是通过CRISPR/Cas9系统进行操作，该技术拥有高效、简单、准确和灵敏的特点。
基因编辑技术可以用于治疗人类常见疾病，例如癌症、遗传性疾病等等；也可以用于基因改造和新药开发。
第三代测序技术原理及应用
洗涤
合成 检测
全内反射显微镜(TIRM)单色成像
Helico BioScience SMS技术
• 测序仪：HeliScope（2008年上市，$1,350,000）
• 优势：样本通量非常高，2 个流动槽可同时运行，每个流动槽有 25 个独立通道，每个通道又可以运行最多 96 个标记分子条形码的样本， 这样每次运行的样本数可高达 4 800 个。把 DNA 聚合酶用逆转录酶 代替还可以进行 RNA 直接测序。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
MinION 测序仪(2014年试用)
Lu H, Giordano F, Ning Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2016;14(5):265-279. doi:10.1016/j.gpb.2016.05.004.
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
总结
• 第三代测序有高通量、 低成本、 长读取长度、 测序时间短等优点， 并且避免了二代测序中 PCR 扩增的环节，因此减少了测序的错误率， 真正的实现了单分子测序。
• 但每种测序技术仍然有许多要加以攻克的挑战，需要用酶的测序技术， 如何保持酶的活性与稳定性就是一个重要的问题，如聚合酶与核酸外 切酶；需要荧光标记的测序技术，怎样提高单分子信号灵敏度同时又 不能把信号变成噪音增加荧光背景也是一个需要解决的事情；还有在 DNA 的固定方面如何保持 DNA 的延展性而不出现二聚体结构等问 题。
第三代测序技术及其应用
第三代测序技术及其应用一、本文概述随着科技的飞速发展，测序技术已成为生物学、医学等领域的重要工具。
自第一代和第二代测序技术问世以来，它们在基因组学、转录组学、表观组学等领域发挥了巨大作用。
然而，随着研究的深入和技术的需求，第三代测序技术应运而生，以其独特的优势在多个领域展现出广阔的应用前景。
本文旨在全面介绍第三代测序技术的基本概念、原理、特点及其在各领域的应用。
我们将从技术的起源和发展入手，详细阐述第三代测序技术的核心原理和技术优势，包括长读长、高准确性、低成本等特点。
我们还将深入探讨第三代测序技术在基因组测序、转录组分析、疾病研究、农业生物技术等方面的实际应用案例，展望其未来的发展方向和潜力。
通过阅读本文，读者将对第三代测序技术有一个全面的了解，能够掌握其基本原理和应用领域，为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、第三代测序技术概述随着生物科技的飞速发展，测序技术作为生命科学领域的一项革命性技术，已经经历了两代重要的变革。
第一代测序技术，即Sanger 测序，以其高精度和准确性在基因组测序中发挥了重要作用，但其通量低、成本高的缺点限制了其在大规模基因组测序中的应用。
第二代测序技术，即高通量测序（Next-Generation Sequencing，NGS），以其高通量、低成本的优势，极大地推动了基因组学、转录组学等领域的研究。
然而，第二代测序技术仍然存在读长较短、数据解读复杂等问题。
在此背景下，第三代测序技术应运而生，以其超长读长、高准确性和实时测序的特点，为基因组学研究带来了新的突破。
第三代测序技术，也被称为单分子测序技术，主要包括单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）和纳米孔测序（Nanopore Sequencing）两种主要类型。
SMRT技术利用荧光标记的单分子DNA为模板，通过实时检测荧光信号的变化来读取DNA序列，具有读长可达数万碱基的特点，使得研究者能够直接获取到完整的基因序列信息。
第三代测序技术原理及应用
SMRT cell
Sequel (2015年)
1,000,000 ZMWs /SMRT cell SMRT cell 的通量提高 7 倍 1/3体积
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
第三代测序技术的基本原理及应用
baby诺安
目录
1. 简介 2. 基本原理 3. 应用
简介
第三代测序技术是指单分子测序技术。不同于二代测序依赖片段化 DNA的克隆性扩增，三代测序技术不需要经过PCR扩增，直接对模板中 的每条DNA分子单独测序，避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。同时 超长读长使得一条read可以横跨基因组上的复杂区段或者重复序列，为 基因组组装及准确挖掘与疾病、进化相关的重复原件、拷贝数变异、结 构性变异提供了技术支持。
成像定位 模板位置
洗涤
合成 检测
全内反射显微镜(TIRM)单色成像
Helico BioScience SMS技术
• 测序仪：HeliScope（2008年上市，$1,350,000）
• 优势：样本通量非常高，2 个流动槽可同时运行，每个流动槽有 25 个独立通道，每个通道又可以运行最多 96 个标记分子条形码的样本， 这样每次运行的样本数可高达 4 800 个。把 DNA 聚合酶用逆转录酶 代替还可以进行 RNA 直接测序。
纳米孔三代测序
纳米孔三代测序
纳米孔测序是第三代测序技术，主要用于生物聚合物的测序，特别是DNA或RNA 形式的多核苷酸。
这种技术可以对单个DNA或RNA分子进行测序，而无需对样品进行PCR放大或化学标记。
在以前开发的任何测序方法中，至少有一个步骤是必要的，而纳米孔测序具有提供相对低成本的基因分型、高测试迁移率和快速处理样品的潜力，并能够实时显示结果。
在纳米孔测序中，主要涉及以下几个步骤：
1. Reader：在自然界中，有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。
经过人为基因工程修饰后，得到的就是纳米孔测序所需的Reader蛋白。
2. Membrane：Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的Membrane（人工合成的多聚物膜）中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。
3. Motor：在纳米孔文库构建时，需要在接头上连接一种动力蛋白，用于将DNA 或RNA分子推入纳米孔中。
以DNA解螺旋酶作为Motor（动力蛋白）为例，它可以除了可以解开双螺旋，使之变为单链，还可以提供推动力。
4. Tether：该蛋白用于锚定DNA或RNA链，防止在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。
5. 通过分析电流信号，使用计算机软件识别后，推断出碱基类型，完成测序。
该技术在快速识别病毒病原体、监测埃博拉病毒、环境监测、食品安全监测、人类基因组测序、植物基因组测序、抗生素耐药性监测、三联体和其他应用中有广泛的应用前景。
单分子测序技术（SMRT）在微生物研究领域中的应用
文章编号：2095－6835（2022）14－0166－05单分子测序技术（SMRT）在微生物研究领域中的应用＊刘梦，庄蕾，余忠祥，吴森（青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810016；青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，青海西宁810016）摘要：近年来测序技术不断革新，获得了突飞猛进的发展。
第三代测序技术又被称为单分子测序技术，能够在单分子水平上读取核苷酸序列，主要以Nanopore、PacBio等为代表。
与传统第一代和第二代测序技术相比，第三代测序可以产生更长的reads，无需逆转录就可以直接进行核酸测序，测序速度也大大提高，一些相关技术设备使用起来也更加方便。
对第三代测序技术的基础理论研究和生物医学的临床实践已被广泛应用。
阐述了第三代测序SMRT在微生物基因组、转录组等组学中的应用，以期为微生物相关研究提供理论参考。
关键词：微生物；SMRT；微生物基因组；微生物转录组中图分类号：Q93-3文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.14.054随着现代科技的迅速发展，生物测序技术已发展到了第三代单分子实时测序（SMRT Sequencing，Single Molecule Real-Time Sequencing），因其高通量、长读长等优点受到了广大研究者的欢迎。
本文对几代测序技术进行了阐述，并对第三代测序技术在微生物研究领域的应用中存在的不足提出改正意见，以期该技术以后在生物领域方面发挥更好的作用，给越来越多的研究人员带来便捷。
1测序技术的发展历程1.1第一代测序技术Sanger的链终止法[1]于1977年登上历史舞台，其主要应用于人类基因组计划（HGP，Human Genome Project），研究学者耗时15年花费30亿美元完成了首个人类基因组图谱。
虽然第一代测序的准确率高达99.999%，并且能达到1000bp，但是它的低通量和高成本限制了其广泛应用。
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95% ile 的读长可达到 6 500bp； 在 X-Long 模到 3 000bp，95% ile 的读长可达到 8500bp。使 个微孔之上，该双分子层中含有很多由 α 溶血素蛋白
用 C2 试剂，每个 SMRT 孔可以获得 90M 的可定位数据 组成的纳米孔（ 图 2b 中紫色区域） 中结合一个核酸外
DOI：10.13523/j.cb.20130520
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2013，33（ 5） ： 125-131
第三代测序技术及其应用*
张得芳1 马秋月2 尹佟明1 夏 涛1，2＊＊
（ 1 南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 南京 210037） （ 2 南京林业大学森林资源与环境学院 南京 210037）
＞ 99% ＞ 98%
＞ 500 万
耗时 / 循环
约 8d
费用 / 百万 个碱基
优点
产量 高，文 库 制 备 简
$1
单，不 需 要 DNA 扩 增
或连接
缺点 错误率高，仪器贵
0． 5-1h
$2
长读长，速度快
在准确性模式下产率 较低，仪器贵
-
20min 2h
-
有潜力达到高读长； 可 以成本生产纳米孔； 无 需荧光标记或光学手 段
新版 C2 试剂推出后，片段平均读长提升至 3 000bp，数 1． 3 纳米孔单分子技术
据量也随之提高了 3 ～ 4 倍。目前公布出来的 C2 试剂
Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术
的参数是： 在 Long 模式下，平均读长可达到 2 500bp， （ 图 2b） 完全不同于前两 特别适合 RNA 直接测序的应用。Helicos 公司的研究 人员利用 tSMSTM 进行 RNA 直接测序的可行性进行了 验证。
该公司 HeliScope 测序仪的优势是样本通量非常 高，2 个流动槽可同时运行，每个流动槽有 25 个独立通 道，每个通道又可以运行最多 96 个标记分子条形码的 样本，这样每次运行的样本数可高达 4 800 个； 缺点是 测序的平均读长相对较短，只有 35 bp，准确率较低，约 为≤97%［11］，还有待于进一步的改进（ 表 1） 。 1． 2 单分子实时合成测序技术
现有的第三代测序平台主要有： Helicos biosciences 公司的 tSMSTM（ true single molecular sequencing） 技术平 台，美 国 Pacific Biosciences 公 司 的 SMRT （ single molecule real-time） 技术平台； 美国 Life Technologies 公 司的基于 FRET 测序技术和美国 Ion Torrent 公司、英国 Oxford Nanopore Nechnologies 公 司 的 纳 米 孔 单 分 子 技 术。本文就该五种第三代单分子测序平台和技术的原 理，优缺点和各方面的应用进行综合介绍。
花的时间较少［16］。
覆盖深度的增加会逐渐被消除。未来随着试剂的不断
Pacific Biosciences 公司第三代单分子实时测序系 优化以及每个 SMRT 孔可获得的数据量的增加，单分
统最初的 C1 试剂测序读长为 1 300bp，数据量也较少。 子测序的原始准确度会逐步提高，且也会进一步提高。
SMRT 测序时，样品准备过程涉及到样品 DNA 的 打断、末端补 齐、连 接 接 头、测 序 这 几 个 步 骤［15］。 测 序
2013，33（ 5）
张得芳 等： 第三代测序技术及其应用
127
中需要的样品量很少，样品准备中所用的试剂也很少， 基，但并未真的将这些碱基掺入合成链中。但这些错
而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程，所以测序所 误是随机的，并不会随着读长的增加而提高，随着测序
摘要 第二代测序技术发展到一定阶段以后其缺陷逐渐显现，而第三代测序技术的出现在一定 程度上弥补了第二代测序技术在应用方面的缺点。就目前正在发展的 5 种第三代高通量测序技 术的原理进行了阐述，并比较了这几种测序技术的优缺点，最后对三代测序技术在基因组测序， 甲基化研究，RNA 测序以及医学方面的应用作了简单介绍。 关键词 第三代测序 单分子测序技术 SMRT tSMS 中图分类号 Q523 + ． 8
收稿日期： 2013-01-15 修回日期： 2013-02-27 * 林 业 公 益 性 行 业 重 大 项 目 （ 201304102 ） 国 家 自 然 基 金 （ 31270711） 资助项目 ＊＊通讯作者，电子信箱： xiataonj@ 163． com
1 测序平台介绍
1． 1 并行单分子合成测序技术 Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序
126
中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 33 No． 5 2013
图 1 Helicos 单分子测序样本的准备及单核苷酸合成反应的图像采集 具体模板核苷酸碱基的加入、清洗及荧光位点的切除等示意图
Fig． 1 Helicos single-molecule sequencing sample preparation and imaging of single-nucleotide incorporation （ a） Image series illustrating template-specific base addition，successful rinsing，and successful linker cleavage （ b）
方法（ tSMSTM ） 技术平台的公司［7-8］，其基础主要来自于 Braslavsky 等人 的 研 究［9］。 主 要 是 利 用 合 成 测 序 理 论［10］（ 图 1） ，测序时首先将待测序列打断成小片段并 在 3'末端加上 polyA（ 图 1a） ，并用末端转移酶阻断（ 图 中标注为 F1） ，同时在玻璃芯片上随机固定多个 polyT 引物（ 其末端皆带有荧光标记） ，将小片段 DNA 模板与 检测 芯 片 上 的 polyT 引 物 进 行 杂 交 并 精 确 定 位 （ 图 1b） ，通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立 边合成边测序的位点（ 图 1c） ； 逐一加入荧光标记的单 色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内 反射显微镜（ total internal reflection microscopy，TIRM） 进行单色成 像 （ 图 1d） ，之 后 切 开 荧 光 染 料 和 抑 制 基 团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入（ 图 1e） 。通 过掺入、检 测 和 切 除 的 反 复 循 环，就 可 以 实 现 实 时 测 序［10］。由于该技术采用了 Cy5 （ 吲哚-5-菁） 荧光基团 （ 具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率，激发 波长在 647nm 处） 和灵敏的监测系统，能够直接记录到 单个碱基的 荧 光，从 而 克 服 了 其 他 方 法 须 同 时 测 数 千 个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。
（ Mappable data） 。现阶段每天最多可运行 12 个 SMRT 切酶。当 DNA 模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶
孔，因此 每 天 可 获 得 12 × 90 = 1 080Mb 的 可 定 位 数 会“抓住”DNA 分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的 DNA
据量。
碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根
多零模式波导孔 （ zero-mode waveguides，ZMW） （ 厚 度 为 100 nm） 的金属片，ZMW 是一种直径只有几十个纳 米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的单个波长，导 致激光无法 直 接 穿 过 小 孔，而 会 在 小 孔 处 发 生 光 的 衍 射，形成局部发光的区域，即为荧光信号检测区（ 图 2a 中的白色区域） ，该区域内锚定有 DNA 聚合酶。测序 时将基因组的 DNA 打断成许多小的片段，制成液滴后 将其分散到不同的 ZMW 纳米孔中。当 ZMW 孔底部聚 合反应发生 时，被 不 同 荧 光 标 记 的 核 苷 酸 会 在 小 孔 的 荧光探测区 域 中 被 聚 合 酶 滞 留 数 十 毫 秒，荧 光 标 记 会 在激光束（ Excitation） 的激发下发出荧光，根据荧光的 种类就可以判定 dNTP 的种类，反应完成后荧光标记会 被聚合酶切除而弥散出 ZMW 小孔，其它未参与合成的 dNTP 由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号 检测区［13-14］。
拍摄帧数； 插入错误源于有时候酶随机的选择一些碱 精确度（ 表 1） 。
表 1 第三代测序技术的各项参数的比较
Table1 The different parameters comparison of the third generation sequencing technologies
测序平台
读长
SMRT 技术对于聚合酶的聚合速度和持续合成能 据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终
力达到一个较好的平衡，所以读长较长，这一点在很大 得出 DNA 分子的序列［20-22］。
程度上优于二代测序 。 ［16-17］ 所以在序列拼接、定位以
纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造
及需要跨越重复区域的应用中有着极大优势。另外， 简单使用成本低廉； 因为它不需要对核苷酸进行标记，
用较低、耗时短［18-19］。
能对修饰过 的 碱 基 进 行 测 序，这 一 点 对 于 表 观 遗 传 学
SMRT 技术的缺陷是会出现插入和缺失错误。缺 研究具有极高的价值； 缺点就是它采用的是水解测序
失错误源于有时候碱基掺入速度过快，超过了相机的 法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序
准确率
Reads / 循环
Helicos（ tSMS） 25 ～ 45bp